第四章 基因表达载体构建.pdf

第四章第四章基因表达载体的构建基因表达载体的构建 主讲主讲：：胡银岗胡银岗 西北农林科技大学农学院植物科学系 本章主要内容本章主要内容  第一节 目的基因的功能与表达分析  第二节 农杆菌Ti质粒转化载体的构建  第三节 植物基因表达载体构建实例 第一节第一节 目的基因的功能与表达分析目的基因的功能与表达分析 一、目的基因功能与表达分析的策略  （一）大肠杆菌表达载体 – 大肠杆菌培养操作简单、生长繁殖快、价格低廉；大肠杆菌 表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统，表达的 目的蛋白量甚至能超过细菌总蛋白量的80 ％。因此大肠杆菌 是目前应用最广泛的蛋白质表达系统。 – 当要将真核基因放入原核细胞中表达产生蛋白质时，原核系 统就会表现出许多缺陷：  没有真核转录后加工的功能，不能进行mRNA的剪接，所以只能表 达cDNA而不能表达真核的基因组基因；  没有真核翻译后加工的功能，表达产生的蛋白质不能进行糖基化、 磷酸化等修饰，难以形成正确的二硫键配对和空间构像折叠，因而 产生的蛋白质常没有足够的生物学活性；  表达的蛋白质经常是不溶的，会在细菌内聚集成包涵体，尤其当表 达目的蛋白量超过细菌体总蛋白量10％时，更容易形成包涵体。 第二节第二节 目的基因的功能与表达分析目的基因的功能与表达分析 一、目的基因功能与表达分析的策略  （二）真核表达载体 – 要表达真核生物的基因，采用真核表达系统比原核系统 优越，常用的有酵母、昆虫、动植物细胞等表达系统。 – 真核表达载体至少要含两类序列：  一是原核质粒的序列，包括在大肠杆菌中起作用的复制起始序列。 以及能用在细菌中筛选克隆的抗药性基因标志等，以便插入真核 基因后能先在很方便操作的大肠杆菌系统中筛选获得目的重组 DNA克隆，并复制繁殖得到足够使用的数量。  二是在真核宿主细胞中表达重组基因所需要的元件。包括启动子、 增强子、转录终止和加poly-A信号序列，mRNA剪接信号序列， 以及能在宿主细胞中复制或增殖的序列，能用在宿主细胞中筛选 的标志基因，和供外源基因插入的单一限制性内切酶识别位点等。 二、基因表达载体构建及分析的基本原理  （一）目的基因的获得和加工 – 1．目的基因的获得 – 2 ．目的基因的加工  为了将目的DNA片段定向克隆到载体中，经常需要 DNA片段具有不同的粘性末端；  要将真核基因在原核生物里表达 – 由于真核生物和原核生物使用的密码子的偏爱性不同 – 常需要将真核基因的DNA序列进行加工，使其符合原核生物 的偏爱密码子 – 至少使基因编码区的几个开始密码子符合原核生物偏爱密码 子。  研究基因功能时常要对目的基因进行定点突变，如研 究一些酶的活性中心或必需基团时，经常采用定点突 变以确定活性位点。 二、基因表达载体构建及分析的基本原理  （一）目的基因的获得和加工 – 3 ．常用的加工方法  ①加接头形成粘性末端  ②通过PCR等方法引入定点突变  ③通过PCR等方法使密码子适应宿主的偏爱性；④ 甲 基化消除一些酶切位点  ⑤去磷酸化减少自连  ⑥末端转移酶催化产生同聚尾  ⑦末端补平 二、基因表达载体构建及分析的基本原理  （二）载体的选择和加工 – 1．载体的选择  目的片段的大小  宿主的差异  是否需要表达  是否需要组织特异性表达或诱导表达