白藜芦醇对肝癌HepG2细胞分化及p21-%27WAF1%2fCIP1-表达影响.pdfVIP

刖 罱 肿瘤细胞具有三个基本特征：一是细胞增殖失控，二是细胞分化受阻，三是 细胞凋亡紊乱。70年代初，人们开始研究是否可以通过诱导分化，使肿瘤细胞 向正常细胞分化，从而得到治疗，大量实验表明，肿瘤起源于一些未分化或微分 化的干细胞，是由于组织更新时所产生的分化异常。最新国内外研究表明，不仅 是非实体瘤，即使象肝癌这种实体瘤，其癌细胞亦可在分化一诱导剂的作用下“改 邪归正，向正常细胞逆转n。71。目前已知的诱导分化剂已有十多种，但多数诱导 剂副作用大，临床应用受到限制。因此，寻找新的高效低毒分化诱导剂与分化疗 法，尤其是毒性较小的天然药物，已成为肿瘤基础与l临床学者研究的重点之一。 白藜芦醇，广泛存在于葡萄科、百合科等(包括我国的传统中药虎杖、何首 乌等)70种植物中，近年来，白藜芦醇由于其广泛的生物学作用，越来越多地 受到人们的关注。白藜芦醇具有保护心肌细胞，改善微循环，抑制血小板聚集， 抵抗内毒素休克，降血脂，抗脂质过氧化、镇咳、平喘，抗病原微生物，抗老年 痴呆等众多生理功能。1997年，美国的科研人员发现白藜芦醇具有抗肿瘤的功 效，表现为对肿瘤的起始、促进和进展三个阶段均有抑制作用陋1。此后，各国科 研人员经过进一步的研究发现，白藜芦醇可通过多种机制对人类肝细胞癌、乳腺 癌、白血病等多种肿瘤细胞产生显著的抑制作用睁151。但是由于白藜芦醇的抗肿 瘤机制比较复杂，可能是几种机制共同作用的结果，也可能还存在其它未知的作 用途径，特别是白藜芦醇诱导肿瘤细胞分化的文献国内外少有报道，因此，有必 要进一步对白藜芦醇抗肿瘤机制特别是其诱导肿瘤细胞分化及其机制进行研究。 本实验前期工作证实，白藜芦醇具有抑制胃癌细胞增殖的作用n引。白藜芦醇 71。 (CyclinDl)的表达，从而抑制胃癌细胞生长n p21w1肥口1为细胞周期负调节因子，为抑癌基因，其基因启动子区富胞嘧 啶．鸟嘌呤．二磷酸核苷，启动子区的组蛋白去乙酰化可能是其抑癌，促分化的重 要调节机制。 因此，本课题瞄准目前肿瘤诱导分化、凋亡这个前沿领域，在前期工作的基 础上，用倒置显微镜观察肝癌细胞的形态改变以及运用放射免疫法测定各组甲胎 蛋白量的变化来探讨白藜芦醇诱导人肝癌细胞分化的作用。用免疫组织化学， 6 RT—PCR等方法来检测白藜芦醇对人肝癌细胞株中p21啪1圮m1的影响，为进一步 阐明白藜芦醇抗癌作用，鉴定诱导分化的关键基因及蛋白质，寻找其作用靶点， 发现肝癌相关生物标记物，并为从分子水平上阐明白藜芦醇诱导人肝癌分化的作 用机理及开拓防治肝癌新途径而奠定基础。 7 主要实验材料及仪器设备 一、肿瘤细胞 人肝癌HepG2细胞株由南华大学肿瘤研究所提供。 二、主要试剂 RPMI一1640干粉 (1)RPMI-1640干粉培养基：美国Gibco公司生产。每10．09 培养基溶于lL三蒸水，调节pH值为7．2—7．4之间，正压过滤除菌分装，4C保 存备用； (2)小牛血清：杭州四季青生物制品有限公司生产。56C灭活30min，分装， -20℃保存备用； (3)青霉素与链霉素：哈尔滨制药六厂生产，需要时用RPMI一1640配成所需的 浓度； (4)PBS液：NaCl0．29、Na2HP04·12H203．49、KH2P040．29(均为 89、KCl 国产分析纯)，溶于1000ml三蒸水，分装，高压灭菌，4C保存备用； 过滤除菌分装，4℃保存备用； 压过滤除菌分装，4℃保存备用； (7)二甲基亚砜(DMS0)：美国Sigma公司生产； (8)白藜芦醇t美国Sigma公司 (9)Trizol试剂盒：上海生工生物工程技术服务有限公司生产； (10)琼糖脂：上海生工生物工程技术服务有限公司生产 (11)MMLV逆转录试剂盒：上海生工生物公司 (12)PCR试剂盒：上海生工生物公司。 (13)引物、DEPC、溴化乙锭：上海生工生物公司 (14)DNAMarker、无RNA酶水：上海生工生物公司 (15)P21w”1肥m