帮助折叠的蛋白质和酶.ppt

化学修饰 双功能聚合物的化学修饰 双功能聚合物的化学修饰是指利用双功能聚合物如戊二醛等将酶蛋白分子之间、亚基之间或在分子内不同肽链之间，共价交联形成交联酶晶体，从而提高酶的稳定性 用戊二醛制备的洋葱假单胞菌脂肪酶交联酶晶体，其转酯活性提高了12倍 单功能聚合物的化学修饰 单功能聚合物的化学修饰是将多糖或多聚物如PEG及其衍生物等活化后，与脂肪酶的侧链氨基相互作用，从而将其偶联到酶分子上。 用多糖偶联C. antarctica（南极洲念珠菌）脂肪酶B后，70℃的半衰期由18min提高到168min 小分子修饰法　　小分子修饰法是利用小分子化合物如醛、酮、羧酸、脂肪酸等与脂肪酶表面暴露的游离羟基、酚羟基、巯基、羧基、氨基等基团反应，从而改变脂肪酶的酶学性质。 利用脂肪酸修饰C. viscosum（染色粘性菌 ）脂肪酶，该酶的酯交换活性从0 mmol/(h·g)提高到270mmol/(h·g)。 脂肪酶的分子进化 分子进化是在分子水平上应用基因工程手段对脂肪酶进行有针对的设计或定向加工，以提高脂肪酶的活性和稳定性，或者创造出具有新功能的脂肪酶。 分子进化方法主要有理性设计、定向进化及多种突变技术的结合 理性设计 理性设计是根据已知脂肪酶的三维结构，利用生物信息学分析脂肪酶蛋白分子结构和功能的关系，确定可以替换或修饰的氨基酸残基、替换氨基酸残基的类型、侧链修饰对脂肪酶催化性能的影响，然后运用定点突变技术完成氨基酸残基的替换。 根据C. antarctica（南极洲念珠菌）脂肪酶B的3D结构特点，将G-S-T保守序列中的T(苏氨酸)突变成G(甘氨酸)，脂肪酶突变体的热稳定性提高了4℃。 利用分子动力学模拟技术结合定点突变技术，C.antarctica脂肪酶B活性中心的色氨酸残基突变为丙氨酸残基，有效地扩大了脂肪酶活性中心的空间，对仲醇的催化活性提高了270倍。 植酸酶 植酸酶可将植物性饲料中植酸及其盐分解为肌醇和磷酸，增加可利用磷的含量，降低植酸对矿物质和蛋白质的亲和力，解除植酸的抗营养作用，从而增加动物对蛋白质和某些金属离子的吸收能力。 植酸酶在饲料中的推广和应用仍然有限，主要原因： (l)植酸酶在天然材料中的含量太低，难以大量生产； (2)植酸酶的热不稳定性不能完全满足饲料加工、贮藏、使用的要求。 目前，用蛋白质工程手段在提高饲用植酸酶的表达量，改善热稳定性和改良植酸酶催化性质等方面已取得较大进展 植酸酶改性的策略 获得具有新的功能和特性酶的方法有两种： 从微生物中筛选，通过基因工程技术，在适合宿主中表达 运用蛋白质工程对已存在酶的DNA或氨基酸序列进行修饰改造 定点突变提高植酸酶的表达量 植酸酶的生产菌株表达量低，难以获得大量产品，使生产成本太高 利用高效表达系统作为生物反应器，大规模低成本地大量生产植酸酶 利用毕赤酵母表达植酸酶可以获得大量产品，表达量由原始菌株的每毫升几微克提高到1-10毫克，并能在酵母中进行糖基化修饰等蛋白质翻译后加工，提高酶的生物活性 为了提高植酸酶在酵母中的表达率，可通过定点突变将部分在毕赤酵母中低偏爱性的密码子替换为高偏爱性的密码子。 对在毕赤酵母中表达的植酸酶基因phyA2进行了Arg密码子的优化突变，将4个Arg密码子(有3个编码Arg密码子是CGG，1个是CGA)突变成高频使用的AGA， Arg密码子优化后其表达量可达每毫升培养液15000u，比Arg密码子没有优化的表达量提高了近37倍。 改善植酸酶的热稳定性 植酸酶熔点在56-63℃之间，加工饲料都需经过一个制粒工艺，在制粒过程中有一个短暂的高温过程，温度一般在75-93℃，而一般植酸酶在此高温下将失活 改良饲用植酸酶的最适PH 要使植酸酶能在畜禽体内产生有效的催化作用，就必须使酶与畜禽的生理条件(体温及消化道的pH值)相适应 不同的动物消化道的pH值不同，即使是一种动物在消化道的不同部位pH值也不同，因此要求饲用酶对pH值有较大的适应范围 通过定点突变改变真菌和同序植酸酶的pH活性范围，用Lys、His替换野生的A.fumigatus (烟曲霉菌 )植酸酶Gly277、Tyr282，将产生第2个最适pH在2.8-3.4。 在同序植酸酶和A.fumigatus中K68A单点突变，以及在植酸酶进行S140Y，D14lG双突变，以植酸为底物将降低最适声值0.5-1.0单位，而酶的比活力没有明显变化。 X射线的发现及应用 1895年 伦琴（Roentgen） 伦琴夫人的手 1901年获第一次诺贝尔物理学奖 X射线衍射 发现x射线在晶体中的衍射，获得了1914年的诺贝尔物理学奖 X射线晶体结构测定基本过程 ①蛋白质获取（纯化） ②晶体生长并经冷冻技