研究EVATHG对机体免疫机能的影响.docVIP

　　研究EVATHG对机体免疫机能的影响 　　乙型肝炎是由乙型肝炎病毒( HBV) 感染引起的以肝脏为主要损害器官的传染病。全球每年约有 450万人感染 HBV，约有 100 万人死于 HBV 感染所致的肝衰竭、肝硬化和原发性肝细胞癌。对于乙型肝炎的传播流行，目前尚无特效的治疗药物，普遍接种疫苗是控制乙型肝炎发生的有效方法。由于全球感染 HBV 的人数众多，感染人群的分布多集中于不发达和贫穷国家，如何使乙肝疫苗更加经济、安全、和易于推广是重要的研究方向。转 HBsAg 基因可食用疫苗苜蓿就是在该领域中的一项有益的探索。苜蓿是一种蛋白质含量高且品质稳定，被认为是最有可能生产重组蛋白质的植物体系。苜蓿在抗病、抗虫、固氮、品质改良等方面获得了广泛的应用，而利用苜蓿作为植物表达载体开发疫苗的研究也日益受到关注。EVATHG 是通过克隆乙型肝炎病毒的外膜小蛋白( S) 及中蛋白( S2＆S) 抗原基因，并通过基因修饰后，构建的分别含有这两种外源基因的高效植物表达载体，是一种可食用的植物疫苗。苜蓿表达的抗原已被证实能延缓和防止某些疾病的发生。但是，转基因植物作为生物新材料，其对健康的影响一直倍受关注。1998 年，苏格兰科学家实验证明，幼鼠在食用转基因土豆后，器官生长异常，体重和器官重量减轻且免疫系统遭受破坏。2008 年，意大利科学家研究证明 MON810 转基因玉米可引起断奶幼鼠免疫系统异常。转基因苜蓿作为一种新型的植物基因重组食用植物疫苗，对于动物或人类均没有接触史，也没有相关的流行病学资料，其对健康的影响在很多方面具有未知性，尤其是在对免疫系统功能的影响方面。 　　本实验以小鼠为受试生物，通过测定小鼠的体液免疫、细胞免疫、非特异性免疫以及免疫器官的病理组织学等相关指标的变化，初步研究 EVATHG 对机体免疫机能的影响，从而为其研发应用提供实验数据。 　　1 材料与方法 　　1． 1 试验材料 　　1． 1． 1 受试物及处理 EVATHG 为绿色粉末，由中国农业科学院生物技术研究所提供。为新鲜的转基因苜蓿草晒干后磨粉，过 200 目筛后制成。实验以蒸馏水为溶媒配制成不同浓度的混悬液供试。 　　1． 1． 2 实验动物和环境条件 实验用 ICR 小鼠由上海西普尔 － 必凯实验动物有限公司提供，实验动物生产许可证号分别为 SCXK( 沪) 2008 －0016，清洁级，雌性，体重20 g plusmn;2 g。实验动物饲料由浙江省实验动物中心提供，执行标准 GB14924 －2001。检测环境条件，实验动物使用许可证号为 SYXK( 浙) 2008 －0106，温度范围20 ℃ ～24 ℃，相对湿度范围 40% ～70%。实验动物试验前在动物房环境中适应3 d。 　　1． 2 方法 　　1． 2． 1 实验分组与剂量 实验设 EVATHG 低、中、高剂量组及阴性对照组( 蒸馏水) 和野生型苜蓿组。 　　按照黄继汉等人介绍的方法算得小鼠的等效剂量大致相当于人推荐剂量的 10 倍，设 1． 0 g/kg 为实验中剂量组，在此剂量的上、下再各设实验低剂量组0． 5 g / kg和实验高剂量组 2． 0 g / kg，分别相当于人推荐剂量的 5 倍和 20 倍。低、中、高三个剂量组分别给EVATHG 0． 5g / kg、1． 0 g / kg、2． 0 g / kg 体重，阴性对照组和野生型苜蓿组则分别给予等体积的蒸馏水和野生型苜蓿( 2． 0 g/kg) 。每项免疫学指标采用清洁级ICR 小鼠 50 只，按体重随机分为 5 组，每组 10 只小鼠。采用灌胃方式给受试物，每天 1 次，灌胃容量按20 ml / kg 体重计，持续 30 d 后进行各项指标测试。 　　1． 2． 2 指标测定 　　 　　1． 2． 2． 1 小鼠免疫器官脏体比的测定及病理组织学检查 实验期末处死动物，摘取中枢免疫器官胸腺及周围免疫器官脾脏，分别称重，计算胸腺/体重和脾脏/体重比值，并用福尔马林固定，常规制片，H． E 染色，进行病理组织学检查。 　　1． 2． 2． 2 ConA 诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验于试验期末，小鼠无菌取脾，置于盛有适量无菌 Hanks液的小平皿中，用镊子轻轻撕碎，制成单细胞悬液，200 目筛X过滤，Hanks 液洗涤 3 次，台盼兰染色计数，最后用 RPMI 1640 完全培养液调整细胞浓度为3 106个/ml。将细胞悬液分两孔加入培养板中，每孔 1 ml，一孔加 60 mu;l ConA 液( 相当于 6 mu;g/ml) ，另一孔作为对照，置 37 ℃、5% CO2培养箱中培养 72 h。 　　培养结束前 4 h，每孔轻轻吸去上清液 0． 7 ml，加入0． 7 ml不含小牛血清的 RPMI1640 培养液，同时加入MTT(