研究SIS对DPSCs的生物相容性及促进牙向分化能力的影响.docVIP

　　研究SIS对DPSCs的生物相容性及促进牙向分化能力的影响 　　小肠黏膜下层(small intestinal submucosa，SIS)作为一种天然的细胞外基质，无抗原性，作为一种细胞支架成功地应用于骨髓基质干细胞、脂肪基质干细胞及肌细胞等多种细胞的实验研究和临床实践，取得了较好的效果，验证了SIS具有较好的安全性和疗效，但小肠黏膜下层能否应用于人牙本质再生与修复的研究，至今国内外罕见报告，我们拟在体外培养人牙髓干细胞(hDPSCs)，采用四唑盐比色法（MTS）、茜素红染色法、碱性磷酸酶(ALP)和逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）方法观察牙髓干细胞在猪小肠黏膜下层的生长情况及测定细胞的牙向分化能力，研究SIS对DPSCs的生物相容性及促进牙向分化能力的影响。 　　材料和方法。 　　1.主要试剂和仪器。低糖型DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、I型胶原酶（Gibco公司，美国)；beta;-磷酸甘油钠、维生素C、茜素红S(Sigma公司，美国)；二甲基亚砜（DMSO）（Nunc公司，美国）；MTS试剂盒（Promega公司，美国）；碱性磷酸酶(ALP)试剂盒（中生北控生物科技股份有限公司）；TRIzol（Invitrogen，美国）；RNA抽提试剂盒、逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）试剂盒（Fer－mentas公司，美国）；牙本质基质蛋白(DMP-1)、牙本质涎磷蛋白(DSPP)及内参beta;-action引物（上海生物工程有限公司）；倒置相差显微镜及照相系统（Olympus公司，日本）；平底96孔培养板、24孔培养板、70mu;m细胞筛X（Falcon公司，美国）；酶联免疫检测仪（BIO-TEK公司，美国)；离心机、二氧化碳恒温孵箱(Forma，美国)；YJ一875型超净工作台(郑州净化设备厂)。 　　2.DPSCs的培养和鉴定 　　2.1DPSCs的原代培养　收集正畸治疗拔除的新鲜年轻恒牙，表面灭菌处理后，无菌条件下取出牙髓，切除根尖约2mm的牙髓，0.01mol／L灭菌PBS冲洗后剪成约lmm1mm1mm大小组织块，0.3％的I型胶原酶37℃消化40min，1000r／min离心5min，弃上清，加入少量培养液，轻轻吹打离散细胞团块，将形成的单细胞悬液通过孔径为70mu;m的细胞筛X，1000r／min离心5min，用含10％胎牛血清的DMEM(含有0.292mg／mL谷氨酰胺、100U／mL青霉素／链霉素)培养液重悬细胞，按1105个／mL的密度接种于培养瓶。置于37℃、5%CO2培养箱内静置培养，每3d换液1次，待细胞生长汇合达80％时，0.25％胰酶消化传代。 　　2.2DPSCs的克隆化培养和鉴定将对数生长期的第三代DPSCs以胰酶消化，反复吹打细胞制成细胞悬液。将细胞悬液调整密度为1105个/mL，乙醇固定30min,PBS洗涤后，加入FITC标记的鼠抗人STRO-1单克隆一抗，于室温孵育1h；PBS再次洗涤后加入羊抗鼠Ig-FITC；流式细胞仪检测细胞表面STRO-1的表达水平。 　　3.SIS制备　取健康成年猪近端空肠约15cm，清水冲洗干净后浸于无菌生理盐水中,刮除浆膜层和肌层,获得SIS。生理盐水反复冲洗后，按文献Abraham方法脱细胞处理,冻干，剪成与96孔板和12孔板的孔大小的材料。环氧乙烷消毒24h备用。 　　4.SIS对DPSCs增殖的影响　将SIS置于96孔板中并加入含10％胎牛血清的DMEM150mu;L，培养24h，弃去原培养液，将DPSCs的单细胞悬液以2104个/孔接种于96孔板材料上，加入DMEM培养，每隔3d换液1次。另设无材料的空白对照组,相同条件培养。 　　分别于培养后1d，3d，5d和7d，取实验组与空白对照组各5个复孔，弃去原培养液，每孔中加入100mu;L无血清培养液和20mu;LMTS，继续在37℃的孵箱中培养4h，将上清移入另外一个96孔板，空白管调零，在酶联免疫检测仪上以490nm波长测定各孔OD值，求均值，绘制细胞生长曲线。 　　5.SIS对DPSCs矿化功能的影响　取体积约2cm3的SIS置于无菌培养瓶内，加入DMEM培养基10mL，于37℃、5%CO2培养箱内浸泡24h，提取上清液，制备成材料浸出液。加入10%胎牛血清，4℃保存备用。将DPSCs的单细胞悬液以2104个/孔接种于12孔板中，加入含10%胎牛血清的DMEM培养液培养，待细胞汇合后，随机分为实验组和对照组，每组5复孔，实验组加入SIS浸提液，对照组用含有10%胎牛血清的DMEM培养液继续培养。每3d换液1次，连续培养3周。进行茜素红染色，倒置显微镜下观察钙化结节形成情况。 　　6．SIS对DPSCsALP的影响　将DPSCs的单细胞悬液以2104个/孔接种于96孔板材料上和无材料的