自然中产淀粉酶菌株分离纯化及酶活测定.docVIP

自然界中产淀粉酶菌株分离 纯化及酶活测定淀粉酶（Amylase）又称糖化酶是指能使淀粉和糖原水解成糊精、麦芽糖和葡萄糖的酶的总称。淀粉酶一般作用于可溶性淀粉、直链淀粉、糖元等α1, 4-葡聚糖，水解α1, 4-糖苷键的酶。根据作用的方式可分为α-淀粉酶（EC 32. 1. 1.）与β-淀粉酶（EC 32. 1. 2. ）。α-淀粉酶广泛分布于动物（唾液、胰脏等）、植物（麦芽、山萮菜）及微生物；β-淀粉酶与α-淀粉酶的不同点在于从非还原性末端逐次以麦芽糖为单位切断α1, 4-葡聚糖链。主要见于高等植物中（大麦、小麦、甘薯、大豆等），但也有报告在细菌、牛乳、霉菌中存在。 淀粉酶是一种用途极广的生物催化剂，广泛应用于造纸、食品、医药工业。如饴糖、啤酒、黄酒、葡萄糖、味精、抗生素等行业；用于高质量的丝绸、人造棉、化学纤维退浆；制成不同品种的工业酶、医用酶、诊断酶等；在洗涤剂工业中，作为洗涤剂酶与碱性蛋白酶、脂肪酶一起添加于洗衣粉中制成多酶洗衣粉等具有极广泛的用途。随着社会需求的增大，工业生产对淀粉酶的需求量越来越大，其在各领域应用广泛，急需寻找更高酶活的产酶菌株满足生产需要。 生淀粉酶是指对不经过蒸煮糊化的生淀粉颗粒能够表现出强水解活性的酶类。70年代由于两次石油危机，引起各国学者从节能和有效利用天然资源出发，重视对生淀粉酶的研究。研究大致分两个方面一是探讨对生淀粉不经蒸煮，直接用于酒精发酵的可能性；另一则是从自然界中分离筛选能产生生淀粉酶的微生物，并进而研究生淀粉酶的酶学特性及其产生菌的徽生物学特性[]。除动物自身的消化道可分泌一些淀粉酶外，淀粉酶的另外两大来源是植物和微生物能产生生淀粉酶的微生物较多。Ueda]，Mizokami[]，Tamiguchi[]，Kainuma[]先后报道了Aspergillus awaraoriRbizopus. sp．，Strepiococcus boris，Bacillus circulans， Chalara paradoxa等菌种均有淀粉能力。 本实验拟从种植谷物的贫瘠土壤和平地肥沃土壤的5cm25cm土层取土壤样品中分离，筛选生淀粉酶菌种，并初步鉴定。5cm~25cm土层取土壤样品。 1.1.2 培养基 (1) PDA 固体培养基[9]：马铃薯 200 g，葡萄糖 20 g，琼脂 20 g，蒸馏水 1000 mL。pH 5.5~6.5 之间，121 ℃灭菌 20 min。 (2) 平板筛选培养基：牛肉膏 5g，蛋白胨 10g，NaCl 5g，可溶性淀粉 20g，琼脂 15~20g，pH 自然，121 ℃灭菌 20 min。 (3) 发酵培养基[10]：蛋白胨 10g，牛肉膏 5g，NaCl 10g，pH 7.0，121 ℃灭菌 20 min。 (4) LB培养基：蛋白胨 10g，酵母膏 5g，NaCl 10g，琼脂 20g，pH 自然，121 ℃灭菌 20 min。 1.1.3 主要试剂配制 DNS试剂[11]：酒石酸钾钠18.2g，溶于50m蒸馏水中，加热，于热溶液中依次加入35-二硝基水杨酸0.03g，NaOH 2.1g，苯酚0.5g，搅拌至溶，冷却后用蒸馏水定容至100m，贮于棕色瓶中，室温保存 CTAB 法所用主要试剂：: 2×CTAB提取液（2%CTAB，200 mmol/L Tris-HCl (pH8.0), 50 mmol/L EDTA(pH8. 0), 1. 4 mol/L NaCl）；10×CTAB 提取液(10%CTAB, 0.7 mol/L N aCl)；TE : 100 mmol/L T ris-HCl (pH8.0)，10 mmol/L EDTA (pH8.0)。 电泳缓冲液：50×TAE（242 g Tris碱和57.1 mL冰乙酸溶于100 mL 0.5 mol/L的EDTA(pH8.0)溶液中，1000 mL）20 mL加蒸馏水至1000 mL；(EB)：5 g溴化乙锭(Ethidium Bromide，EB)，10 mL，，1000倍，0.5 μg/mL；1.01.0 g，加热使之溶于100 mL的电泳缓冲液，L EB，100 mg/mL）：溶解1 g氨苄青霉素钠盐于足量的水中，最后定容至10 mL。分装成小份于-20℃贮存。以50 μg/mL的浓度添加于生长培养基。 大肠杆菌质粒提取相关试剂：溶液Ⅰ：50m，25mTris.HCl(pH8.0)，10mEDTA；II：0.2 mol NaOH，1%SDS)；III：5 mKAc溶液pH 4.8；：；（2524:1）；；750.05 mol/L CaCl2溶液；15%甘油的0.05 mol/L CaCl2溶液；(宝生物工程有限公司)：pMD19-T Vector*1(50 ng/μ)，co