肾缺血预处理对细胞内钙超载和脂质过氧化损伤的影响.pdfVIP

材料与方法 1．1实验材料 中心提供)。 ELITE 心机，LEICADMLB间接免疫荧光显微镜，EPICSESP流式细胞检测仪(美国 COULl陋R公司)，BT2000医学图像分析系统(成都泰盟有限公司)，721型分光光度计。 1．1．3实验试剂 x．100)，碘化丙啶(PI)， 多聚赖氨酸，胶原酶I，细胞打孔液(仃iton 北京中杉金桥生物技术有限公司)。苦昧酸，二乙酰．肟试剂盒(北京北化康泰公司)。SOD、 司)。O．OlⅧBS。 1．2实验方法 1．2．1实验动物分组及模型制备 (1)动物分组：将88只健康雄性SD大鼠随机分为11组，I a～Va(I／R)组分别 为缺血再灌注0、1、24、48、72h组；Ib．Vb(IPC．I瓜)组为缺血预处理后缺血再灌注 (2)动物模型制备： 切除右肾，无菌纱布覆盖切口，稳定30分钟。 ②I／R组动物模型的制备：分离左肾动脉，用无创动脉夹夹闭左肾动脉45min后松 夹恢复灌流。I 清液备用，同时无菌取左肾于冰块上，沿肾门正中纵行切开左肾，一半用于测定细胞内 [Ca2+】i，另一半保存于lo％的中性甲醛液中备用。 肾采集Ib～Vb组标本。 ④St姗组动物模型的制备：只分离左肾动脉，暴露45min，不进行动脉夹闭，采 集血清及左肾标本。 1．2．2肾功能检测按苦昧酸和二乙酰．肟试剂盒试剂盒说明书用比色法测定大鼠血清 肌酐(Scr)和尿素氮(BUN)水平。 1．2．3肾组织形态学观察将10％中性甲醛固定的肾组织行石蜡包埋，4啪切片，常规 2 山西医科大学硕士学位论文 脏染色封片后，光镜下每张切片选取8．10个高倍视野观察肾脏的组织形态学改变。 1．2．4原位细胞凋亡检测将固定于lO％中性甲醛中的肾组织行脱水、透明、石蜡包埋， 4哪切片，按1rI肥L试剂盒说明书处理肾组织制片，同时作阳性及阴性对照，封片后光 镜下观察，n胍L阳性细胞为凋亡细胞，细胞核呈棕黄色。每只鼠制片1张，每张切片 选取8个高倍视野统计阳性细胞数。 1．2．5脂质过氧化损伤有关指标测定按试剂盒说明书采用比色法检测各组中血清 SoD和MDA含量。 l。2．6肾小管上皮细胞内【ca2+】i测定 (1)肾小管上皮细胞的提取、鉴定： 4．2， 0．4，CaCl2 0．4Na2HP04 1．0，高压除 MgS04 1．O，NaHC0325，NaH2P04 0．5，glycine 菌，每次使用前按5mmol／1加入glucose【8】。 ②分离肾小管上皮细胞：剥去左肾组织包膜，取皮质层，用细胞悬液冲洗后剪 碎，置于80目网筛上研磨，细胞悬液冲洗顺序经100目、300目网筛过滤，收集滤液， 离心(1000～1200r／m缸×5mill)取沉淀。 ③肾小管上皮细胞鉴定 40min； 片上，晾干后丙酮固定5mhl，PBS冲洗3次，每次3．5min； c．tritonx-100(O．15ml+PBS 99．8m1)破膜10min，PBS洗3次； 玻片置于4℃湿盒中过夜； PBS洗3次，吸去多余水分，甘油封片； ￡间接免疫荧光显微镜观察鉴定肾小管上皮细胞：CKl8阳性为肾小管上皮细胞， 呈圆形或椭圆形，阳性部位为细胞浆：FactorⅧ阳性为毛细血管内皮细胞，呈扁平状； 上，偶见Ⅵmentin阳性细胞，无F∞torⅧ(图1)。 (2