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荧光定量PCR的应用与革新
荧光定量PCR的应用与革新
杭州宝诚生物技术有限公司 市场部
提 纲
1 实时荧光定量PCR的方法与应用
2 MIQE
3 第三代PCR-数字PCR
定量分类
绝对定量：用已知量的标准品做标准曲
线，推算未知的样本中基因的拷贝数或浓
度。
相对定量：样本中目标序列相对于另一参
照样本的量的变化。常用于比较样本中基
因表达水平的高低变化，得到的结果是百
分比。
实时荧光定量PCR法——标准样品
绝对定量的标准样品：
已知拷贝数的质粒DNA和体外转入的RNA
相对定量中的内标
• 内标通常是β-actin 、GAPDH基因等看家基因
•在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，
受环境因素影响小
• 内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量
DNA 产物的荧光标记
非特异性荧光标记：
1、 SYBR Green (不饱和染料)
2、Eva Green（饱和染料）
特异性荧光标记：
2、TaqMan
3、Molecular Beacon
SYBR Green 法 工作机理
SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位
• SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光
• 变性时，DNA双链分开，无荧光
• 复性和延伸时，形成双链DNA， SYBR Green 发
荧光，在此阶段采集荧光信号。
SYBR Green 法 应用范围
起始模板的测定
基因型的分析
融解曲线分析
溶解曲线分析
融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，
对常规PCR有指导意义，如对primer的评价；
可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物。
change in fluorescence
T
m
single amplified
product
Melt Curve
Check specificity of the reaction
Melt curve showing two amplified products
T
m
Two amplified
products Tm
SYBR Green 法 优缺点
优 点
缺 点
对DNA 模板没有选择性 容易与非
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