仪器分析一高效液相色谱.pptVIP

第六章 高效液相色谱法 (High Performance Liquid Chromatography，HPLC) 1906年，俄国生化学家茨维特第一个运用玻璃柱分离植物色素，并取得较好的分离效果，成为世界公认的液相色谱的奠基人。但受当时技术条件的限制，这种经典的柱色谱由于柱效、回收率、重现性等因素的影响，未能迅速发展。 高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代末70年代初发展起来的一种新型分离分析技术，随着不断改进与发展，目前已成为应用极为广泛的化学分离分析的重要手段。 它是在经典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点。 1．高效液相色谱法与经典液相色谱法 高效液相色谱法比起经典液相色谱法的最大优点在于高速、高效、高灵敏度、高自动化。 2．高效液相色谱法与气相色谱法 （l）气相色谱法分析对象只限于分析气体和沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数的20％。对于占有机物总数近80％的那些高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质，目前主要采用高效液相色谱法进行分离和分析。 (2)气相色谱采用流动相是惰性气体，它对组分没有亲和力，即不产生相互作用力，仅起运载作用。而高效液相色谱法中流动相可选用不同极性的液体，选择余地大，它对组分可产生一定亲和力，并参与固定相对组分作用的剧烈竞争。因此，流动相对分离起很大作用，相当于增加了一个控制和改进分离条件的参数，这为选择最佳分离条件提供了极大方便。 (3)气相色谱一般都在较高温度下进行的，而高效液相色谱法则经常可在室温条件下工作。P296 总之，高效液相色谱法是吸取了气相色谱与经典液相色谱优点，并用现代化手段加以改进，因此得到迅猛的发展。目前高效液相色谱法已被广泛应用于分析对生物学和医药上有重大意义的大分子物质，例如蛋白质、核酸、氨基酸、多糖类、植物色素、高聚物、染料及药物等物质的分离和分析。 §6.1 HPLC的主要类型及选择 广义地讲，除柱色谱外，薄层色谱（液—固色谱）和纸色谱（液—液色谱）也属于LC。 狭义的LC指柱色谱。按分离机理，柱色谱法可分为液—固吸附色谱、液—液分配色谱、键合相色谱、离子色谱等。 6.1.1液—固吸附色谱法 液---固吸附色谱是以固体吸附剂作为固定相，吸附剂通常是些多孔的固体颗粒物质（如硅胶、氧化铝等），在它们的表面存在吸附中心。液固色谱实质是根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分离的。 1．分离原理 当流动相通过固定相（吸附剂）时，吸附剂表面的活性中心就要吸附流动相分子。同时，当试样分子（X）被流动相带入柱内，只要它们在固定相有一定程度的保留就要取代数目相当的已被吸附的流动相溶剂，于是，在固定相表面发生竞争吸附: X + nSad = Xad + nS 2.固定相 液---固吸附色谱所用固定相多是一些吸附活性强弱不等的吸附剂，如硅胶、氧化铝、聚酸胶等。由于硅胶的优点较多，如线性容量较高，机械性能好，不溶胀，与大多数试样不发生化学反应等，因此，以硅胶用得最多。 在液---液色谱中，流动相和固定相都是液体，它能适用于各种样品类型的分离和分析，无论是极性的和非极性的，水溶性和油溶性的，离子型的和非离子型的化合物。 1.分离原理 液液分配色谱的分离原理基本与液液萃取相同，都是根据物质在两种互不相溶的液体中溶解度的不同，具有不同的分配系数。所不同的是液液色谱的分配是在柱中进行的，使这种分配平衡可反复多次进行，造成各组分的差速迁移，提高了分离效率，从而能分离各种复杂组分。 3．流动相 在液液色谱中为了避免固定液的流失，对流动相的一个基本要求是流动相尽可能不与固定相互溶，而且流动相与固定相的极性差别越显著越好。 根据所使用的流动相和固定相的极性程度，将其分为正相分配色谱和反相分配色谱。 6.1.3化学键合相色谱法 采用化学键合相的液相色谱称为化学键合相色谱法，简称键合相色谱。由于键合固定相非常稳定，在使用中不易流失，适用于梯度淋洗，特别适用于分离容量因子k值范围宽的样品。由于键合到载体表面的官能团可以是各种极性的，因此它适用于种类繁多样品的分离。 用来制备键合固定相的载体(基体），几乎都用硅胶。 6.1.4 凝胶色谱法 凝胶色谱又称分子排阻色谱法 主要用于较大分子的分离。与其他液相色谱方法原理不同，它不具有吸附、分配和离子交换作用机理，而是基于试样分子的尺寸和形状不同来实现分离的。 尺寸排阻色谱被广泛应用于大分子的分级，即用来分析大分子物质相对分子质量的分布。 它具有其他液相色谱所没有的特点：（1）保留时间是分子尺寸的函数，有