蛋白质工程第六章 现代生物技术在蛋白质工程中的应用.pptVIP

第六章 现代生物技术在蛋白质工程中的应用 蛋白质芯片技术 表面等离子体共振技术 噬菌体表面展示技术 蛋白质分子印迹技术 蛋白质芯片技术 概念 蛋白质微阵列( Protein microarray) ，将大量蛋 白质有规则的固定在某种介质载体上，利用蛋白质 与蛋白质、酶与底物、蛋白质与其他小分子之间相 互作用检测分析蛋白质的一种芯片。 一般指固定于支持介质上的蛋白质构成的微阵列。 蛋白芯片的结构 基本原理 将各种蛋白质有序地固定于滴定板、滤膜和载玻片等各种载体上成为检测用的芯片； 用标记了特定荧光抗菌素体的蛋白质或其他成分与芯片作用，将未能与芯片上的蛋白质互补结合的成分洗去； 利用荧光扫描仪或激光共聚焦扫描技术，测定芯片上各点的荧光强度，通过荧光强度分析蛋白质与蛋白质之间相互作用的关系，由此达到测定各种蛋白质功能的目的。 分类 蛋白质功能芯片 蛋白质检测芯片 制备方法 固相载体的选择和处理 蛋白质标靶的处理及固定 蛋白质芯片的封闭 蛋白质芯片的特点 快速、定量分析大量蛋白质 使用简单，结果正确率高 样品用量少 ?检测速度快 蛋白质芯片的应用 表面等离子体共振技术（SRP） 概念和原理 SPR技术是一项基于物理光学现象的先进生化检测技术，通过测量分子结合导致的芯片表面折射率变化来检测多种生物分子的结合过程。 芯片表面折射率的变化与吸附在金属表面的物质有关，将配体分子固定于芯片的金属膜表面，监控溶液中被分析物与该配体的结合过程。在复合物形成或解离过程中，芯片表面溶液的折射率发送变化，随机产生SPR信号。 特点： 无需标记或报告基因可测定大分子的相互作用 测定是一个动态分析过程 测定不直接接触样品 噬菌体表面展示技术 原理 噬菌体表面展示技术是将外源蛋白分子或多肽的基因克隆到丝状噬菌体基因组中，与噬菌体外膜蛋白融合表达，展示在噬菌体颗粒的表面。由于外源蛋白或多肽的基因型和表型统一在同一噬菌体颗粒内，因此，通过表型筛选就可以获得它的编码基因。 特点：高通量筛选 噬菌体展示技术的基本原理 酵母表面展示技术 原理 其基本原理是将外源靶蛋白基因(外源蛋白)与特定的载体基因序列融合后导入酵母细胞,利用酵母细胞内蛋白转运到膜表面的机制使靶蛋白固定化表达在酵母细胞表面。 特点 酵母是真核细胞,它有一套可以处理蛋白分泌途径的“生物合成装置”,能够对新生蛋白进行有效折叠和糖基化。 可以通过荧光激活细胞分类技术对表达文库进行快速和定量筛选 可以展示在细胞表面的单个克隆的突变特性,如亲和力和稳定性等 蛋白质分子印迹技术 定义 模拟自然界中所存在的分子识别作用，以目标分子 为模板合成具有特殊分子识别功能的分子印迹聚合物。 连接方式：共价 非共价：氢键、离子键、疏水作用 分子印迹技术的基本原理 制备方法： 在一定溶剂（也称致孔剂）中，模板分子与功能单体依靠官能团之间的共价或非共价作用形成主客体配合物； 加入交联剂，通过引发剂引发进行光或热聚合，使主客体配合物与交联剂通过自由基共聚合在模板分子周围形成聚合物； 将聚合物中的印迹分子洗脱或解离出来。 基于生物分子与药物靶分子（抗体、受体、抗原、酶的底物等）的亲和力，应用噬菌体表面展示技术可以从多肽库中进行快速筛选，从而成为药物开发的强有力工具。 噬菌体展示技术就是将天然免疫和获得性免疫个体中分离的抗体基因插进噬菌体DNA中。抗体分子包括抗体的可变区域，该区域能与抗原结合，称作scFv，被连接到噬菌体衣壳蛋白上。噬菌体感染大肠杆菌后，单链DNA在宿主内复制，并且噬菌体重新组装，分泌到培养基中去，同时不会裂解宿主大肠杆菌。噬菌体与靶标抗原孵育，结合上去的噬菌体分离后，扩增，纯化。这种方法能轻易的筛选大量的克隆。 噬菌体展示技术就是将天然免疫和获得性免疫个体中分离的抗体基因插进噬菌体DNA中。抗体分子包括抗体的可变区域，该区域能与抗原结合，称作scFv，被连接到噬菌体衣壳蛋白上。噬菌体感染大肠杆菌后，单链DNA在宿主内复制，并且噬菌体重新组装，分泌到培养基中去，同时不会裂解宿主大肠杆菌。噬菌体与靶标抗原孵育，结合上去的噬菌体分离后，扩增，纯化。这种方法能轻易的筛选大量的克隆。 这样在聚合物中便留下了与模板分子大小和形状相匹配的立体孔穴，同时孔穴中包含了精确排列的与模板分子官能团互补的由功能单体提供的功能基团，如果构建合适，这种分子印迹聚合物就象锁一样对此钥匙具有选择性。这便赋予该聚合物特异的“记忆”功能，即类似生物自然的识别系统，这样的空穴将对模板分子及其类似物具有选择识别特性。 (1) 功能单体－印迹分子－结合 (2) 交联剂－固定 (3) 脱去－印迹分子 * * 芯片 折射率变化，随机产生SPR信号 Pre