高中化学：5.2多聚酶链式反应扩增dna片段).pptVIP

④计算 DNA含量（ ?g ）＝50 x (260nm的读数） x 稀释倍数 50：1 ?g /ml的DNA在厚度为1cm比色杯中的吸光值为0.02 比色杯 四、 课题延伸 例如：PCR产物每轮循环增加一倍，30轮循环扩增量达230个拷贝（109拷贝） PCR技术是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。 它具有特异、敏感、产率高、 快速、 简便、重复性好、易自动化等突出特点 五、实验小结 PCR仪加热使（ ）变性, 复性使引物与模板DNA（ ）,延伸需将反应温度升至中温( ),在（ ）的作用下,以 （ ）为原料,以（ ）为复制的起点,合成新链。 如此重复改变反应温度,经（ ）三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍; 将扩增产物进行电泳,经溴化乙锭染色,在紫外灯照射下肉眼能见到扩增特异区段的DNA带。 模板 互补 Taq聚合酶 四种脱氧核苷酸 引物 变性、复性和延伸 72℃ 多聚酶链式反应扩增DNA片断 脱氧核苷酸结构式 一、基础知识 O O P O HO 碱基 O OH O O P O HO OH 碱基 5’ 3’ 3’ 5’ 碱基 脱氧核糖 磷酸基团 碱基 脱氧核糖 碱基 脱氧核糖 5’ 3’ 通常将DNA的 羟基“－OH”末端称为3’端， 而磷酸基团的末端称为5’端 （一） PCR(多聚酶链式反应） 1、 为什么需要引物？ 不能从头合成DNA， 只能从DNA的3′端开始延伸DNA链， 因此， DNA复制需要引物 2、 DNA聚合酶作用方向 当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后， DNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链， DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸 （从母链的3′端向5′端延伸） 3、 PCR原理 ①在80－100°C的温度范围内， DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性 ②当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链 ③ PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合，现在使用的PCR仪实质上也是一台能够自动调控温度的仪器 高温解决了打开双链的问题，但是，又导致DNA聚合酶失活的问题，耐高温的Taq DNA聚合酶解决了高温导致DNA聚合酶失活的问题，促成了PCR技术的自动化 4、 Taq DNA聚合酶的应用 5、 缓冲液需要为PCR反应提供的物质 DNA模板，分别与两条模板链相结合的两种引物，四种脱氧核苷酸，耐热的DNA聚合酶，同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行 PCR过程需要的引物不是RNA，而是人工合成的DNA单链，其长度通常为20－30个脱氧核苷酸 PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的 PCR过程中的反应环境是缓冲液，不是细胞内液 6、细胞内复制和PCR不同点 PCR技术是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。 它具有快速、高效、灵活和易于操作等突出优点 7、 PCR技术原理复杂 操作十分简单 （二） PCR的反应过程 1、PCR的反应步骤 PCR一般经历三十多次循环， 每次循环可以分为三个基本步骤 ──变性、复性和延伸 ①变性（模板DNA解旋） 模板DNA经加热至900C以上， 双链DNA聚为单链。 2、循环过程 靶序列 靶序列 PCR 循环第一步 ：加热变性 ②复性（退火） 模板DNA经加热变性成单链后，温度降到500C左右， 两种引物与两条DNA单链的互补序列配对结合 靶序列 靶序列 引物 Ⅰ 引物 Ⅱ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ PCR 循环第二步 ：引物与靶序列退火 ③延伸 温度上升到720C左右，溶液中的四种的脱氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下，按碱基互补配对的原则，合成新的DNA链 靶序列 靶序列 引物Ⅰ 引物Ⅱ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ Taq DNA 聚合酶 PCR 循环第三步 ：引物延伸 靶序列 靶序列 第1个 PCR 循环完成后 ：得到两个拷贝的靶序列 循环次数 DNA数量 1 2 2 4 3 8 20 1,048,576 30 1,073,741,824 3、30次循环后靶序列扩增的数量 4、PCR 循环的结果 ② DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增 ①从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与