基于磷酸化组蛋白H2AX的酶联免疫检测方法评价卷烟烟气-分析化学.PDFVIP

第42 卷 分析化学 (FENXI HUAXUE)摇 研究报告 第3 期 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 2014 年3 月 Chinese Journal of Analytical Chemistry 320 ~325 DOI:10.3724/ SP.J.1096.2014.31006 基于磷酸化组蛋白H2AX 的酶联免疫检测方法 评价卷烟烟气基因毒性 * * 付立伟摇 陈欢摇 杨 进摇 侯宏卫 摇 胡清源 (国家烟草质量监督检验中心,郑州450001) 摘摇 要摇 基于酶联免疫原理,建立了定量测定细胞中磷酸化组蛋白H2AX(酌H2AX)含量的新方法,并用于评 价卷烟烟气的基因毒性。 采用不同剂量的烟气气相物与烟气粒相物暴露于中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞), 通过测定不同染毒时间下细胞中酌H2AX含量水平变化,考察烟气染毒与细胞DNA损伤的剂量效应关系,以 及不同烟气组分基因毒性的差异。 此外,通过定量监测细胞中活性氧的变化,探讨卷烟烟气暴露诱发细胞 DNA双链断裂损伤的作用机理。 结果表明,随烟气暴露时间的增加,细胞中酌H2AX 的含量在几小时内达到 峰值,然后逐渐下降;染毒浓度越高,细胞中酌H2AX含量达到峰值的时间越长;随着烟气粒相物或气相物染 毒浓度的增高,细胞中酌H2AX含量水平呈上升趋势;烟气粒相物染毒相比烟气气相物对细胞中酌H2AX含量 的影响更为显著;此外,烟气成分直接染毒会引起细胞内活性氧的含量增加。 细胞内活性氧的含量变化与细 胞DNA双链断裂标志物酌H2AX 的含量变化有较强相关性,卷烟烟气中自由基成分可能是诱发细胞DNA双 链断裂的原因之一。 关键词摇 磷酸化组蛋白H2AX;酶联免疫方法;基因毒性 1摇 引摇 言 H2AX是组蛋白2A家族成员之一,在 DNA双链断裂(DNA double stranded breaks,DSBs)修复中起 主要的信号传输作用。 当细胞发生DSBs后,H2AX 的丝氨酸残基可以被毛细血管共济失调突变基因 (Ataxiatelangiectasiamutated,ATM)和DNA依赖性蛋白激酶(DNA鄄dependentproteinkinase,DNA鄄PK)等 磷酸化,形成磷酸化组蛋白H2AX(酌H2AX)[1~3]。 酌H2AX迅速在DSBs位点簇集,且酌H2AX 的形成与 [4] 双链断裂的数量成正比 ,从而使酌H2AX成为DNA损伤/ 双链断裂的重要的特异性生物标志物。 烟 [5] 气中某些组分(如自由基)能直接作用于细胞中DNA ,或通过活化多环芳烃(例如苯并芘)生成多环 [6] 芳烃DNA加合物 ,最终导致各种形式的DNA损伤。 其中,DNA双链的断裂被认为是最严重的DNA 损伤,DSBs修复失败可触发细胞凋亡,甚至破坏DNA信息,继而导致突变、癌症和遗传损害。 因此,基 于酌H2AX这一特异性生物标志物检测卷烟烟气暴露引起的细胞DNA损伤,尤其是DSBs,将有助于评 [7] 价卷烟烟气的基因毒性。 Albino等 通过荧光显微镜观测发现,经过烟气冷凝物暴露后细胞内酌H2AX [8] 的荧光焦点数量增多,且与暴露剂量呈正相关;此外,Toyooka和Ibuki 检测出细胞中酌H2AX含量与烟 气暴露呈现剂量效应关系。 其采用的荧光显微镜方法可以获得单个细胞中酌H2AX 的焦点数量