植物活性多糖的分离纯化与鉴定.doc

实验、 多糖的分离、纯化与鉴定 第一部分多糖的提取、纯化 目的了解多糖提取和纯化的一般方法。实验原理多糖类物质是除蛋白质和核酸之外的又一类重要的生物大分子。早在60年代，人们就发现多糖复杂的生物活性和功能。 多糖的纯化，就是将存在于粗多糖中的杂质去除而获得单一的多糖组分。一般是先脱除非多糖组分，再对多糖组分进行分级。常用的去除多糖中蛋白质的方法有：Sevag法、三氟三氯乙烷法、三氯醋酸法，这些方法的原理是使多糖不沉淀而使蛋白质沉淀，其中Sevag方法脱蛋白效果较好，它是用氯仿：戊醇或丁醇，以4：1比例混合，加到样品中振摇，使样品中的蛋白质变性成不溶状态，用离心法除去。 本实验采用Sevag法(氯仿：正丁醇＝4：1混合摇匀)进行脱蛋白，用DEAE 层析柱进行纯化，然后合并多糖高峰部分，浓缩后透析，冻干，得多糖分。多糖被浓硫酸水合产生的高温迅速水解，产生单糖，并迅速脱水生成醛糖衍生物，在这种强酸条件下与苯酚反应生成橙色衍生物，该衍生物在波长490 nm 处和一定浓度范围内，吸光度与糖浓度呈线性关系，采用比色法对多糖含量进行测定。试剂和器材试剂 5%苯酚溶液·12H2O NaH2PO4·2H2O 乙醚 平衡缓冲溶液：0.01mol/L Tris-HCL, PH=7.2。 洗脱液：A: 0.1mol NaCl, 0.01 mol Tris-HCl PH=7.2; B: 0.5mol NaCl, 0.01 mol Tris-HCl PH=7.2。Sevag试剂氯仿：正丁醇＝3：1材料 。 3.器材 DEAE-纤维素，离心机，透析层析柱 ×30cm) 【操作方法一、粗多糖的提取 将切碎烘干后称，采用热水浸提法，每次原料和水之比均为1：，浸提温度为80，浸提时间h，共提取4次，合并4次浸提液。浓缩一倍体积。对多糖提取液需进行脱色处理，即以1％的比例加入活性炭，搅拌均匀15min后过滤即可。在浓缩液中加入3倍体积的95%乙醇搅拌，置冰箱24 h沉淀为多糖和蛋白质的混合物，此为粗多糖。 它只是一种多糖的混合物，其中可能存在中性多糖、酸性多糖、单糖、低聚糖、蛋白质和无机盐，必须进一步分离纯化。二、粗多糖的纯化 粗多糖溶液(氯仿：正丁醇＝3：1混合摇匀)振荡20 min，3 000 r/min的转速下，离心15 min，上清液测其体积，继续加相应体积的，并重复上述操作，直至氯仿层与正丁醇层之间无。　　将倒入下端扎好的截流分子量为6 000～8 000的半透膜袋中，将袋的另一端用绳扎好后，悬挂在盛有水的烧杯里，将烧杯放在磁力搅拌器上，开动搅拌，蒸馏水透析48 h，期间每2h更换一次水，经常更换清水使透析膜内溶液的浓度差加大，并加以搅拌，加快透析速度，除去无机盐、单糖、双糖等小分子杂质。加3倍体积95%乙醇醇沉。沉淀放入干燥，获得白色固体粉末，即得精制多糖。、多糖的1?.样品溶液的制备 　　精密称取适量样品，用蒸馏水溶解，定容至0 ml，即为待测样液。 2?标准曲线的制备 　　精密称取105干燥至恒重的葡萄糖标准品1 g，置于100 ml容量瓶中，溶解并稀释至刻度，配成10 mg/ml的标准贮备液，吸上述贮备液1 ml定容至100 ml，配成0.1 mg/ml的工作液。精密移取葡萄糖标准液0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6 ml于25 ml具塞刻度试管中，加蒸馏水至2.0 ml，再各加5%苯酚溶液1.0 ml摇匀，迅速加入浓H2SO4溶液5 ml，振摇5 min，放置10 min，置沸水浴中加热20 min，取出冷却至室温，于490 nm，以试剂空白为参比测定吸光度。多糖制定因素水平表：考察四个因素（），每个因素取三个水平（如温度选择、 和 三个水平）。如表1。表1 因素水平表 A每次提取时间 B温度 C料液比 D提取次数 水平 (h) （℃） (n) 1 0.5 75 1：10 2 2 1.0 80 1：15 3 3 1.5 85 1：20 4 利用正交试验设计，选择正交表L9（34）表试验号 时间(h) 温度(℃ ) 料液比 次数 吸光度 (%) 1 0.5 75 1:15 2 2 0.5 80 1:20 3 3 0.5 85 1:25 4 4 1.0 75 1:20