生物化学实验项目学生用(张艳馥).docVIP

实验一、圆形滤纸层析法分离氨基酸 一、实验目的 了解并掌握氨基酸纸层析的原理和方法 二、实验原理 1、纸层析是以滤纸为支持物的层析。包括水平层析、垂直层析。垂直层析中又包括上行法和下行法。本实验为水平层析，其点样点为滤纸中心。 2、纸层析所用展层剂大多为水和有机溶剂组成。 水：与纤维素亲和力较强——固定相 有机溶剂：与纤维素亲和力较弱——流动相 3、不同氨基酸由于R基的不同，极性不同因此在两相中的分配系数不同，所以氨基酸随流动相流动的速度不同，于是将不同的氨基酸分离开，形成距原点距离不同的层析点。 4、溶质在滤纸上的移动速率用比移Rf表示 Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离 层析条件不变Rf为常数，故可根据Rf值作定性依据。 三、实验器材 1、圆形滤纸（直径15cm）、滤纸条 2、毛细管 3、培养皿（直径12cm左右） 4、电吹风 5、喷雾器 6、剪刀、圆规、铅笔、格尺 四、实验药品 1、标准氨基酸溶液：0.5%脯氨酸、0.5%亮氨酸、0.5%精氨酸 2、展层剂：正丁醇：醋酸：乙醇：水=4：1：1：2混合后的上清液 3、显色液：0.1%茚三酮-乙醇（95%）液 4、混合氨基酸：将上述各氨基酸液等量混合 五、实验步骤 1、滤纸处理：（1）分区找原点（2）做滤纸桥（3）画点样原点 2、点样：用不同毛细管分别蘸取不同样品点至相应区域的点样原点，样点直径不超过3mm，吹干或自然干燥，少可补点一次。 3、层析：（1）取培养皿一个，加入展层剂（2）将点样后的滤纸桥向下平放于培养皿上，并使纸桥浸入展层剂中（3）取等大的、干燥的培养皿盖于其上进行展层（4）待展层剂达到培养皿边缘时层析结束，取出并用铅笔划一前沿线（5）用电吹风吹干 4、染色：用0.1%茚三酮浸染后，吹干即出现层析点 六、实验分析 1、计算（1）各已知氨基酸的Rf（2）计算各未知氨基酸的Rf（3）确定未知氨基酸的种类 2、讨论（1）为什么不同氨基酸通过层析可以被分开，影响Rf的因素有哪些？（2）列出至少2种其他的层析方法，并简述其原理 实验二、酪蛋白的制备及其等电点的测定 一、实验目的 1、了解蛋白质的两性性质与等电点及蛋白质沉淀的关系 2、掌握沉淀法测定蛋白质的等电点的原理和方法 二、实验原理 1、提取（1）牛乳中含有丰富的酪蛋白（2）酪蛋白为两性物质，等电点为4.7（3）等电状态蛋白质易形成沉淀，调节牛乳的pH=4.7则酪蛋白沉淀出来（4）酪蛋白不溶于乙醇，故可用乙醇进行提纯 2、等电点测定（1）等电点时蛋白质溶解度最小，溶液的混浊度最大（2）配制不同pH的缓冲液，观察蛋白质在这些缓冲液中的溶解情况即可确定代白质的等电点 三、实验器材 1、离心机 2、水浴锅 3、量筒（100ml）、烧杯（400ml、500ml） 4、试管（15ml）、试管架、移液管（10ml、2ml、1ml） 5、研钵 6、锥形瓶（200mol、100mol） 四、实验药品 1、牛奶 2、95%乙醇、无水乙醚 3、0.2mol/LpH4.7醋酸—醋酸钠缓冲液：177A液+123B液混合 A液：0.2M醋酸钠溶液；B液：0.2M醋酸溶液 4、干酪素 5、1mol/L醋酸钠溶液 6、1mol/L、0.1mol/L、0.01mol/L醋酸溶液 五、实验步骤 （一）酪蛋白的提取 1、提取（1）取牛乳100ml与400或500ml烧杯中，放入40℃水浴锅中预热（2）取100mlpH4.7的缓冲液100ml同样预热到40℃（3）将缓冲液加入到牛乳中，边加边搅拌，最终调pH为4.7（4）冷却后倒入离心杯中3000转离心15min，取出后去上清的酪蛋白粗品 2、洗涤（1）用蒸馏水洗涤沉淀3次，每次3000转10min（2）用30ml乙醇洗一次（3）乙醇-乙醚等量混合液洗一次（4）无水乙醚洗一次 3、干燥 将沉淀瘫在表面皿上，风干 （二）酪蛋白等电点测定 1、0.4%酪蛋白醋酸钠的配制：（1）称取0.4g干酪素加少量蒸馏水在研钵中仔细研磨（2）将研磨好的酪蛋白转至200mol锥形瓶中，并用少量温水洗涤研钵，将洗液并入锥形瓶中（3）加入10mol1mol/L醋酸钠溶液后置50℃水浴中，摇动至酪蛋白完全溶解（4）将溶解后的酪蛋白液转至100mol锥形瓶中蒸馏水定容至刻度，塞紧混匀。 2、等电点测定： （1）取同样规格的4支试管，按下表操作后混匀 　试管号 　蒸馏水（mol） ） 　1MOL/l醋酸(mol) 　1 2 3 4 　8.4 8.7 8.0 7.4 　0.6 — — — 　— 0.3 1.0 — 　— — — 1.6 (2)向以上各管中加入酪蛋白醋酸钠液各1mol，加以管混一管，此时各管pH依次为5.9、5.3、4.7、3.5（3）观察各管浊度，静止10min后再观察各管浊度，确定