革兰氏染色的一般步骤.docVIP

革兰氏染色一般步骤革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，1884年由丹麦医师Gram创立。未经染色之细菌，由于其与周围环境折光率差别甚小，故在显微镜下极难观察。染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，而用以分类鉴定。革兰氏染色属复染法，即将标本固定后，先用结晶紫染色1分钟后水洗，然后加革兰碘液媒染一分钟后用酒精脱色，再用稀释石炭酸红复染。染色后除可以看到细菌形态外，还可将细菌分为两大类，即不被酒精脱色而保留紫色者为革兰氏阳性菌（G＋）。被酒精脱色复染成红色者为革兰氏阴性菌（Gˉ）。革兰氏染色原理尚不肯定，可能与细菌所带核糖核酸、细菌壁结构通透性、等电点等因素有关。致病菌如金黄色葡萄球菌、绿色溶血性链球菌、肺炎球菌、白喉杆菌、炭疽杆菌等属革兰氏染色阳性菌。百日咳杆菌、大肠杆菌、伤寒杆菌、痢疾杆菌、霍乱弧菌、流行性脑膜炎双球菌、淋病双球菌等均属革兰氏阴性。所以根据细菌的革兰氏染色性质，可以缩小鉴定范围，有利于进一步分离鉴定，以对疾病做出诊断。又由于各种抗生素的抗菌谱不同，革兰氏染色尚可做为选用抗生素的参考。 革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是： 1）涂片固定。 2）草酸铵结晶紫染1分钟。 3）水冲洗。 4）加碘液覆盖涂面染1分钟。 5）水洗，用吸水纸吸去水分。 6）加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，30秒后水洗，吸去水分。 7）红色液（稀）染10秒钟后，水冲洗。干燥，镜检。 染色的结果，革兰氏正反应菌体都呈紫色，负反应菌体都呈红色。1-2min，倾斜后缓慢冲洗，用吸水纸吸干。 （2）媒染：滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，倾斜后缓慢冲洗，吸水纸吸干。 （3）脱色：将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，倾斜玻片，用95％酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约20～30秒钟，立即用水冲净酒精。 （4）复染：用番红液染1～2分钟，水洗。 （5）镜检：自然干燥后，置油镜观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。 （6）同法在一载玻片上以大肠杆菌与金黄色葡萄球菌混合制片，作革兰氏染色对比。 注意：革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。 五、实验结果与讨论 微生物染色液的配制 一、吕氏(Loeffler)碱性美蓝染液 　　 A液：美蓝(methylene blue) 0．6g 　　 95%酒精 30ml 　　 B液：KOH 0．01g 　　 蒸馏水 100ml 　　 分别配制A液和B液，配好后混合即可。 二、齐氏(Ziehl)石炭酸复红染色液 　　 A液：碱性复红(basic fuchsin) 0．3g 　　 95%酒精 10ml 　　 B液：石炭酸 5．0g 　　 蒸馏水 95ml 　　 将碱性复红在研钵中研磨后，逐渐加入95%酒精，继续研磨使其溶解，配成A液。 　　 将石炭酸溶解于水中，配成B液。 　　 混合A液及B液即成。通常可将此混合液稀释5—10倍使用，稀释液易变质失效，一次不宜多配。 三、革兰氏(Gram)染色液 　　 1．草酸铵结晶紫染液 　　 A液：结晶紫(crystal violet) 2g 　　 95%酒精 20ml 　　 B液：草酸铵(ammonium oxalate) 0．8g 　　 蒸馏水 80ml 　　 混合A、B二液，静置48小时后使用。 　　 2．卢戈氏(Lugol)碘液 　　 碘片 1．0g 　　 碘化钾 2．0g 　　 蒸馏水 300ml 　　 先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液中，待碘全溶后，加足水分即成。 　　 3．95%的酒精溶液(脱色用)。 　　 4．番红复染液 　　 番红(safranine O) 2．5g 　　 95%酒精 100ml 　　 取上述配好的番红酒精溶液10ml与80ml蒸馏水混匀即成。 四、芽孢染色液 　　 1．孔雀绿染液 　　 孔雀绿(malachite green) 5g 　　 蒸馏水 100ml 　　 2．番红水溶液 　　 番红 0．5g 　　 蒸馏水 100ml 　　 3．苯酚品红溶液 　　 碱性品红 11g 　　 无水酒精 100ml 　　 制法取上述溶液10ml与100ml5%的苯酚溶液混合，过滤备用。 　　 4．黑色素(nigrosin)溶液 　　 水溶性黑色素 10g 　　 蒸馏水 100ml 　　 称取10g黑色素