利用三通道实时荧光成像方法研究单个活细胞凋亡与胞浆pH值变化的关系.pdfVIP

第29卷，第6期 光谱学与光谱分析 2O09年6月 and Analysis Junc，2009 SpcctroscopySpectral 利用三通道实时荧光成像方法研究单个活细胞凋亡与 胞浆pH值变化的关系 林丹樱，刘晓晨，马万云。 清华大学原予分子纳米科学教育部重点实验室。北京 lo0084 摘要利用双波长分光器(Dual—v．ew)和自制滤光片滑块，在基于像增强型电荷耦合器件(1ccD)的实时／ 快速荧光成像系统基础上，建立了一种基于单个IcCD的三通道实时荧光成像方法，同时发展了相应的图像 v-FITc和 校准处理方法用于消除光谱串扰的影响，并将该方法应用于单个活细胞的研究。利用Anne妇n SNARF_l两种荧光探针进行双标记，在单细胞水平上对哑硝基谷胱甘肽(GSNo)诱导小鼠胸腺细胞凋亡与 其胞浆pH值变化的关系进行实时研究。结果揭爪了GsNo诱导的细胞凋亡与细胞发生自发凋亡时胞浆pH 值自-不旧的变化规律，为这种三通道实时荧光成像方法在生物医学领域的应用展示了广阔的前景。 关键词三通道；实时荧光成像；活细胞；凋亡；胞浆pH值 中图分类号：TH74文献标识码：A DOI：lo．3964／j．issnlooo_0593(2009)06一1581-05 引言 1方法 随着高速度、高分辨率科学型电荷耦合器件(charge-1．1三通道实时荧光成像方法的建立 coupleddevice，cCD)在荧光显微成像系统中的应用，基于面本文介绍的二通道实时荧光成像方法是在基于像增强型 CcD(intensificd 激发的宽场荧光显微成像技术以灵敏度高、特异性好、成像 CCD，l(℃D)的实时／快速荧光最微成像系 速度快、对细胞尤损伤等特点，已成为牛物医学领域实时检 统【41基础上建市起来的。该系统具有灵敏度高、适合微弱荧 测活细胞内部特征及其运动变化最适用的手段之一【lqJ，尤 光成像、自动化程度高等特点，在单个活细胞研究领域已取 l所示：光 其足用于单个活细胞的研究方面I：：5。7]。而荧光探针及其标记 得一些重要研究成果【5j。-i通道方法的建立如I冬I 方法的快速发展，使研究者可以利用两种或两种以上的荧光 闸s将成像视野缩小一半，利用Dual一view双波艮分光器 探针同时对活细胞中不同的分子、离子进行标记，并实时检 测多个特征波长的荧光信号，是一种有效的多参数研究方 荧光分成不同波长的两束同时成像在IccD的不同区域上， 法[810]。对每个特征波长荧光信号的检测成像通常称为一个 左、右各l／2像素采集[图1(a)]；推入滤光片滑块(方框② 通道(Channel)。多通道实时荧光成像一般需要先对荧光信 号进行分光、滤光，然后利用多个CCD对不问波长的荧光同 所示；自制)，同时将Dual—View双波长分光器抽出，实现通 时进行成像。本文利用Dual—View双波长分光器和自制滤光 片滑块，建立了一种基于单个CCD的t通道实时荧光成像I和通道Ⅱ问时成像，可用于同时性要求较高的检测，如『司 方法，既节约了成本，又避免了不问的0CD因检测灵敏度、 一种荧光探针不同特征波长荧光的比率法定昔检测；通道Ⅲ 量子效率等不同而带来的系统误差。利用这种方法，我们在 与通道I／Ⅱ非同时成像所得，可用于同时性要求不太高的 单个活细胞水平f：对小鼠胸腺细胞凋亡与胞浆pH值变化的 场合。 关系进行了实时研究，为该方法在生物医学领域的应用展示 1．2荧光探针的光谱特性及