2.蛋白质及化学.ppt

* 烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University (三)根据电离性质不同的分离方法 电泳法和离子交换层析 1.电泳法:带电颗粒在电场中向着所带电荷相反方向移动称为电泳. 原理:不同的蛋白质因结构、形状和带电量的不同而有不同的泳动速度,从而可以进行分析和分离. 分类：根据支持物的不同，可分为：薄膜电泳，凝胶电泳.　 * * 烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University a)SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS) SDS:十二烷基硫酸钠,变性剂 普通蛋白质电泳的泳动速率取决于荷质比: 净电荷,大小,形状 用SDS和巯基乙醇(打开二硫键)处理 蛋白质变性并与SDS结合,形成SDS-蛋白质复合物,使蛋白质分子均带负电. 0.4g-1.4g SDS/1g 此方法只能测得 亚基肽链的相对分子质量 * * 烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University 十二烷基硫酸钠 Sodium dodecyl sulfate 分子式：CH3(CH2)11OSO3Na 分子量：C12H25NaO4S=288.38 性状：白色或浅黄色结晶或粉末. 熔点：180℃（分解）. 十二烷基磺酸钠  Sodium dodecyl sulfonate 分子式：CH3(CH2)11SO3Na 分子量：C12H25NaO3S=272.38 性状：白色或浅黄色结晶或粉末. 熔点：300℃. * * 烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University 水平式电泳装置 垂直式电泳装置 * * 烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University 　b） 等电点聚焦电泳（ IFE） ：形成pH梯度,不同蛋白质聚集到各自等电点位置. * * 烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University C 双向电泳 第一向：等电聚焦电泳 第二向：SDS双向电泳后的凝胶经染 色后蛋白呈现二维分布图： 水平方向反映出蛋白在pI上的差异， 垂直方向反映出它们在分子量上的差别. * * 烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University 2.离子交换层析(Ion-exchange chromatography) 常用的阳离子交换剂为羧甲基纤维素(CM-C) 阴离子交换剂为二乙氨基乙基纤维素(DEAE-C) * * 烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University 2.离子交换层析(Ion-exchange chromatography) 常用的阳离子交换剂为羧甲基纤维素(CM-C) 阴离子交换剂为二乙氨基乙基纤维素(DEAE-C) * * 烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University (四)根据配基特异性的分离纯化方法 亲和层析法(affinity chromatography):蛋白质和 相应配基的亲和力具有高度特异性和可逆性特点. 抗原、Protein A和抗体，酶与底物等. * * 烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University 二、蛋白质的纯度的鉴定 1.层析法 高压液相层析法 (HPLC) 2.电泳法 高压毛细管电泳法(HPCE) 3.免疫化学法 放射免疫分析(RIA) 酶标记免疫分析法(ELISA) 4.N－末端测序 * * 烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University 三、分子量测定的方法 根据氨基酸的数目 20种氨基酸的平均分子量为128 肽键个数=缩合失水分子数=氨基酸分子总个数－肽链条数 已知20种氨基酸的平均分子量是128，现有一蛋白质 分子由两条多肽链组成，共有肽键98个,问此蛋白质 的分子量最接近于（ ） 11036 * * 烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University 较精确测定分子量的主要方法有超速离心法、分子筛层析法、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、生物质谱法等. * * 烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University a）超速离心法 高速离心力作用下,蛋白质分子会沿旋转中心向外周 方向移动,用光学方法测定界面移动的速度即