基因工程大肠杆菌基因工程.ppt

第十三章 大肠杆菌基因工程 D 基因工程菌的遗传不稳定性及其对策 A 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征 B 外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理 C 大肠杆菌基因工程菌的构建策略 D 基因工程菌的遗传不稳定性及其对策 E 利用重组大肠杆菌生产人胰岛素 融合型目的蛋白表达系统的构建 用于融合蛋白构建的受体蛋白： 谷胱甘肽转移酶（GST） 维持良好空间构象 硫氧化还原蛋白（TrxA） 维持良好空间构象 pTrxFus 麦芽糖结合蛋白（MBP） 促进分泌 金黄色葡萄球菌蛋白A（SAPA） 免疫亲和层析 pRIT2T 外膜蛋白（OmpF） 促进分泌 b-半乳糖苷酶（LacZ） 免疫亲和层析 泛素蛋白（Ubi） 维持良好空间构象 目的蛋白的回收 受体蛋白部分的存在可能会影响目的蛋白的空间构象和生物活性；如果注入人体还会导致免疫反应。因此在生产药用目的蛋白时，将融合蛋白中的受体蛋白部分完整除去是必不可少的工序。融合蛋白的位点专一性断裂方法有两种： 化学断裂法 酶促裂解法 目的蛋白的回收 用于蛋白位点专一性化学断裂的最佳试剂为溴化氰（CNBr）它与多肽链中的甲硫氨酸残基侧链的硫醚基反应，生成溴化亚氨内酯，后者不稳定，在水的作用下肽键断裂，形成两个多肽降解片段其中上游肽段的甲硫氨酸残基转化为高丝氨酸残基，而下游肽段N端的第一位氨基酸残基保持不变。这一方法的优点是回收率高(可达到85%以上)，专一性强，且所产生的目的蛋白的N端不含甲硫氨酸，与真核生物细胞中的成熟表达产物较为接近。然而，如果异源蛋白分子内部含有甲硫氨酸残基，则不能用此方法。 化学断裂法： 目的蛋白的回收 酶促裂解法：单残基位点 蛋白内切酶 切割位点 梭菌蛋白酶 Arg-C 葡萄球菌蛋白酶 Glu-C 假单孢菌蛋白酶 Lys-C 猪胰蛋白酶 Arg-C Lys-C 蛋白酶酶促裂解法的特点是断裂效率更高，断裂位点专一性强。在多肽链中的精氨酸、谷氨酸、赖氨酸残基处切开酰胺键，形成不含上述残基的下游断裂肽段。但前提条件是外源蛋白分子内部不能含有精氨酸、谷氨酸或赖氨酸残基，而大分子量的异源蛋白含这三种氨基酸残基的比率相当高。 Arg C N N C 受体蛋白 目的蛋白 目的蛋白的回收 酶促裂解法：多残基位点 为克服单一残基的蛋白酶的应用局限性，可在受体蛋白编码序列与不含起始密码子的外源基因之间加装一段编码寡肽序列（Ile-Glu-Gly-Arg）的人工接头DNA片段，该寡肽为具有蛋白酶活性的凝血因子Xa的识别和作用序列，其断裂位点在Arg的C末端。纯化后的融合蛋白用Xa处理，即可获得目的蛋白。由于Xa的识别作用序列由四个氨基酸残基组成，大多数蛋白质中出现这种寡肽序列的概率极少，因此可广泛用于回收各种目的蛋白。 目的蛋白的回收 酶促裂解法：多残基位点 启动子 受体基因 接头 目的基因 Met Stop Ile-Glu-gly-Arg Ile-Glu-gly-Arg 表达 亲和层析 酶解回收 寡聚型异源蛋白的表达 通过增加质粒拷贝数,以提高目的蛋白产量往往不能获得满意的效果。 既增加外源基因剂量又能提高目标蛋白产量的有效方法是构建寡聚串联型异源蛋白表达载体，即将多个拷贝的外源基因串联后克隆在一个低拷贝质粒上，以取代高拷贝载体仅含单拷贝外源基因的策略。 以寡聚形式表达目的蛋白的优缺点 目的蛋白高效表达 在不提高质粒拷贝数的前提下，增加目的基因的拷贝数，可以在一定程度上改善表达量 稳定表达小分子短肽 短肽由于缺乏有效的空间结构，在细菌细胞中的半衰期较短。串联短肽具有与蛋白质相似的长度及空间结构，因而抗蛋白酶降解的能力大幅度提高 目的产物回收困难 寡聚短肽需要裂解和进一步分离，才能获最终分子，但裂解后的短肽分子容易出现序列不均一性 寡聚型目的蛋白表达系统的构建 P SD gene gene gene gene T1 T2 H2N COOH Met Met Met Met mRNA CNBr 基本战略： 整合型异源蛋白的表达 以整合形式表达目的蛋白的优缺点 目的基因稳定表达 整合型的目的基因随受体细胞染色体DNA的复制而复制，相当稳定，工程菌在没有选择压力存在下可以连续培养而不丢失目的基因表达盒，这对以改良物种遗传性状为目的基因工程案例特别有意义 目的基因表达率低 单拷贝整合的目的基因表达率受到限制，此时可通过强化表达元件而加以补偿 DNA体内重