引物primer-昆明医科大学.PPT

许冰莹, Tel:0871Email:bingying_xu@126.com 昆明医科大学法医学院 聚合酶链式反应 polymerase chain reaction, PCR 一种模拟人体DNA半保留复制原理，在体外扩 增特异性目的DNA片段的技术，经过PCR，可 在数小时内，使目的DNA片段获得百万个的拷 贝，便于后续的分析和检测。 DNA Denaturation（DNA变性） 通过加热（94 ℃ ）使模板DNA双链间氢键断裂，双链解离形成两条单链DNA的过程。 DNA Annealing（DNA退火） 又称DNA复性，将反应体系降温（60 ℃ ），引物与单链模板DNA按照碱基互补配对的原则重新形成模板-引物杂化双链的过程。 DNA Extension（DNA延伸） DNA聚合酶在适当温度条件下（72℃）催化4中dNTP原料按照碱基互补配对原则从引物的3’末端开始渗入，延模板有5’?3’方向延伸，合成一条新的DNA链的过程。 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 例如IL-3 ： 5‘GCTCCATGA---------TGAGTCCAA 3‘—正链 --ACTCAGGTT 5‘—负链 上游引物：与其5‘→3端的序列相同 5-GCT CCA TGA -3 下游引物： 相应互补链5→3序列相同 5-TTG GAC TCA -3‘ 靠近5’上游Primer与双链DNA正链相同，3’下 游Primer与负链相同。 1.变性温度与时间 一般93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性 ——若低于93℃则需延长时间 ——但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性 有影响。 此步若不能使靶基因模板完全变性，就会导致PCR失败。 2.退火(复性)温度与时间 取决于引物的长度、碱基组成（GC含量）及其浓度，还有靶序列的长度。 退火温度是影响PCR特异性的重要因素： 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。 复性时间:一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合. 延伸温度：一般在70～75℃之间，常用温度为72℃。 此时TaqDNA聚合酶活性最高。 延伸时间：靶序列长度 1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min（足够） -扩增10Kb需延伸至15min 延伸时间过长会导致非特异性扩增。 对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。 预变性(93-95?C,2-5m) 变性(93-95?C,30s) 退火 (50-70?C,30s) 延伸(75?C,30-60s) 总延伸(75?C,7m) (25-35) PCR的一般过程： 经过30次的循环, 扩增的DNA片段可达100万倍以上。 ＊二.PCR反应体系 Taq DNA聚合酶(Taq DNA polymerase ) 引物(primer) dNTP(A、T、C、G) 模板(template) Mg2+（PCR buffer） 标准的PCR反应体系（ 100?l ） 4种dNTP混合物 各200 ?mol/L（A、C、T、G） 引物 　　　　 　各10～100pmol（上游引物、下游引物） 模板DNA 　　　 0.1～2 ?g Taq DNA聚合酶 2.5u 缓冲液 Mg2+ 　　 1.5mmol/L KCl 50mmol/L Tris-HCl(Ph8.4) 10mmol/L 0.001%明胶或牛血清蛋白 What’s in the Tube Target DNA 5’ 3’ 3’ 5’ primers A B dNTP Taq DNA polymerase Mg2+ Mg2+ Mg2+ Mg2+ Mg2+ Mg2+ Buffer containing magnesium 1.Taq DNA聚合酶（Taq DNA polymerase） 最适温度：72℃， 半衰期：92.5℃130min ；95℃ 40min ；97.5℃ 5—6min。 酶量增加使反应特异性下降; 酶量过少影响反应产量。 1.Taq DNA聚合酶（Taq DNA polymerase） 水生栖热菌(thermus aquaticus,Taq)的DNA聚合酶。 ①5’?3’DNA聚合酶活性； ②无3’?5’外切酶活性，没有引物3’ 端错配碱基的校正功能， 35轮循环有0.25%错配，与原始模板 有差别。 人工合成的寡核苷酸序列,与靶DNA片段两侧翼的序列互补。 引物序列限定了PCR产物的长度和特异性。引物浓度一般为0.1～ 0.5?m