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中国试剂网 3.12.2.1 增加PCR 特异性 1、引物设计 细心地进行引物设计是PCR 中最重要的一步。理想的引物对只同目的序列两 侧的单一序列而非其他序列退火。设计糟糕的引物可能会同扩增其他的非目的序 列。下面的指导描述了一个可以增加特异性的引物所具有的令人满意的特点： 1.典型的引物18 到24 个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序 列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24 核苷的引物并不意味着更 高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短 序列杂交慢，从而降低了产量。 2.选择GC 含量为40 ％到60 ％或GC 含量映像模板GC 含量的引物。 3.设计5端和中间区为G 或C 的引物。这会增加引物的稳定性和引物同目的序列 杂交的稳定性。 4.避免引物对3末端存在互补序列，这会形成引物二聚体，抑制扩增。 5.避免3末端富含GC 。设计引物时保证在最后5 个核苷中含有3 个A 或T 。 6.避免3末端的错误配对。3端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。 7.避免存在可能会产生内部二级结构的序列，这会破坏引物退火稳定性。 目的序列上并不存在的附加序列，如限制位点和启动子序列，可以加入到引物 5端而不影响特异性。当计算引物Tm 值时并不包括这些序列，但是应该对其进 行互补性和内部二级结构的检测。 有时候，对于引物设计仅了解有限的序列信息。比如，如果仅知道氨基酸序列， 可以设计兼并引物。兼并引物是指代表编码单个氨基酸所有不同碱基可能性的不 同序列的混合物。为了增加特异性，可以参考密码子使用表，根据不同生物的碱 基使用偏好，减少兼并性。次黄嘌呤可以同所有的碱基配对，降低引物的退火温 度。不要在引物的3端使用兼并碱基，因为3端最后3 个碱基的退火足以在错误 位点起始PCR 。使用较高的引物浓度（1μM 到3μM ），因为许多兼并混合物中的 引物不是特异性针对目的模板。 2 、引物退火温度 引物的另一个重要参数是熔解温度（Tm ）。这是当 50 ％的引物和互补序列表 现为双链DNA 分子时的温度。Tm 对于设定PCR 退火温度是必需的。在理想状 中国试剂网 3.12.2.1 态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以 减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比引物 的Tm 低5℃。 设定Tm 有几种公式。表4 列出确定引物Tm 最常用的两种方法。第一个公式 来源于高盐溶液中的杂交，适用于小于 18 碱基的引物。第二个公式根据GC 含 量估算Tm 。确定引物Tm 最可信的方法是近邻分析法。这种方法从序列一级结 构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。大部分计算机程序使用近邻分析 法。 根据所使用的公式及引物序列的不同，Tm 会差异很大。因为大部分公式提供 一个估算的Tm 值，所有退火温度只是一个起始点。可以通过分析几个逐步提高 退火温度的反应以提高特异性。开始低于估算的Tm5℃，以2 ℃为增量，逐步提 高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。为获得 最佳结果，两个引物应具有近似的Tm 值。引物对的Tm 差异如果超过5℃，就 会引物在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。如果两个引物 Tm 不同，将退火温度设定为比最低的Tm 低 5℃。或者为了提高特异性，可以 在根据较高Tm 设计的退火温度先进行5 个循环，然后在根据较低Tm 设计的退 火温度进行剩余的循环。这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷 贝。 3、递减PCR 递减PCR 通过在PCR 的前几个循环使用严紧的退火条件提高特异性。循环开 在比估算的 Tm 高大约5℃的退火温度下开始，然后每个循环降低 1℃到2 ℃， 直到退火温度低于Tm 5℃。只有同同源性最高的目的模板会被扩增。这些产物 在随后的循环中继续扩增，并会将扩增的非特异性产物排挤出去。递减 PCR 对 于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法较为有用，如AFLP DNA 指纹 分析。 4 、引物浓度 引物的浓度会影响特异性。最佳的引物浓度一般在0.1 到0.5μM 。较高的引物 浓度会导致非特异性产