药学细胞实验笔记(概念实验注意分析计算).docVIP

IC50 是指“反应”被抑制一半时抑制剂的浓度，这里的反应可以是酶催化反应、抗原抗体反应等。在凋亡方面，可以理解为一定浓度的某种药物诱导肿瘤细胞凋亡50%，该浓度称为50%抑制浓度，即凋亡细胞与全部细胞数之比等于 50%时所对应的浓度，IC50 值可以用来衡量药物诱导凋亡的能力，即诱导能力越强，该数值越低,当然也可以反向说明某种细胞对药物的耐受程度。 半抑制浓度（或称半抑制率），即 IC50。在间接竞争 ELISA 标准曲线中是一个非常重要的数据，标准曲线是一个 S 型曲线。 ICELISA中，不添加抑制物质的对照孔的OD值为B0, 添加了抑制物质的孔的OD值为B。 B/B0% 就叫做结合率， 在结合率为 50%时所对应的抑制物质的浓度就叫做IC50。 一般 IC50 的数值越小，说明你的抗体的特异性能越强！ 最小检测限为试剂盒标准曲线的最小的浓度，小于最小浓度或大于最大浓度，即不在曲线范围内的都不准确，大于最大浓度可以稀释后测。 IC50 为 50%抑制浓度即 B/B0=50%时所对应的浓度，半数抑制是用来衡量抗体灵敏度的半数抑制越低，说明抗体的灵敏度越高。 检测下限一般为理论值，是根据标准曲线算出来的理论上可以检测到的最小的值。 定量限为实际检测时可以定量的最低的值 最大检测限就是实际操作中抑制率达到 100%时的药物浓度。 检测下限（LOD）对应的 OD 值：OD(LOD) =B0－3SD 定量限（LOQ）对应的 OD 值：OD（LOQ）= B0－10SD 酶活力单位（U，active unit） 酶活力的度量单位。1961 年国际酶学会议规定：1个酶活力单位是指在特定条件（25℃，其它为最适条件）下，在1分钟内能转化1微摩尔底物的酶量，或是转化底物中 1 微摩尔的有关基团的酶量。 酶活力单位：用来表示酶活力大小的单位，通常用酶量来表示。 其中一个称酶活力国际单位，规定为：在特定条件下，1分钟内转化1微摩尔底物，或者底物中1微摩尔有关基团所需的酶量，称为一个国际单位（IU，又 称 U）。 另外一个国际酶学会议规定的酶活力单位是 Kat，规定为：在最适条件下，1秒钟能使1摩尔底转化的酶量。 Kat 和U的换算关系：1 Kat=6×107U， 1U=16.67n Kat 酶的比活力（specific activity）：是指每毫克质量的蛋白质中所含的某种酶的催化活力。是用来度量酶纯度的指标。是生产和酶学研究中经常使用的基本数据。 酶的转化数(Kcat)：在单位时间内每一活性中心或每分子酶所能转换的底物分子数。生产中并不常用。 Michaelis-Menten 曲线(X 轴底物浓度 Y 轴速度)，处理后得到 Km 和 Kcat。 一、原理 噻唑兰，简称 MTT，可透过细胞膜进入细胞内，活细胞线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性 MTT 还原为难溶于水的蓝紫色的 Formazan 结晶并沉积在细胞中，结晶物能被二甲基亚砜（DMSO）溶解，用酶联免疫检测仪在 490nm 波长处测定其光吸收值，可间接反映细胞数量。 二、试剂材料准备与实验仪器 1）对数生长期细胞 2）受试因素（药物） 3）MTT：以 PBS 配制成 5mg./ml，抽虑除菌，保存在 4?C 4）DMSO（二甲基亚砜） 5）96 孔板 6）酶联免疫检测仪 7）细胞培养箱 三、实验步骤（实用于贴壁细胞） 1）收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，分于 96 孔板，1×104/孔，细胞浓度可以调整。 2）置 37℃、5%CO2 温箱培养使细胞贴壁。 3）加入不同浓度的药物，如 1、5、10、40、50、80、160、320mg/ml 的药物，时间依据实验需要，一般3天。 4）小心吸去上清，PBS 轻轻洗涤，再次离心，弃上清。 5）每孔加入 180ul新鲜RPMI1640培养液，再加入 20 ul MTT 溶液（5 mg/ml，即 0.5%MTT），继续培养4 h。 6）终止培养（可离心，1000 rpm，10 min），小心吸去孔内培养液。 7）每孔加入 150 ul 二甲基亚砜（也可以用酸化异丙醇，10%SDS 代替），置摇床上低速振荡 10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490 nm 处测量各孔的吸光值。 8）同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定 3 复孔。 三、结果统计学处理 所有数值以 x±s 表示，应用 SPSS 软件进行方差分析，p0.05 时为相差显著，p0.01 时为相差非常显著。可以以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生线，专门公式 求 IC50。或计算抑制率。 四、注意事项与常见问题 1）实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。