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血红蛋白在有机溶剂中的直接电化学 及其类酶电催化行为研究 关凌霄 王全林 (固原师范高等专科学校 固原 宁夏 756000) 摘要：本文研究了Hb/Sol-gel膜修饰碳糊电极在有机溶剂介质中的直接电化学和类过氧化物酶电催化特性。发现在以甲醇、正丙醇和乙睛介质中，Hb修饰电极能够实现其与电极之间的直接电子转移，并且电子转移的动力学过程与水溶液体系相似。然而，在这些有机溶剂介质中，电子转移的可逆性不如水介质中好，同时氧化还原峰电位差均大于水溶液体系，表明有机溶剂对Hb的直接电子转移产生抑制作用。Hb/Sol-gel修饰电极在有机溶剂介质中和水介质中一样，对其特异性底物H2O2产生过氧化物酶的活性，但其活性均不如水溶液体系强。 关键词：血红蛋白；有机溶剂；直接电化学；Sol-gel；碳糊电极； 1．前言 血红蛋白（Hb）分子是由四条肽链（亚基）借非共价连接聚集而成，每一条肽链与一个亚铁血红素结合，血红素位于肽链折叠所形成的介电常数较低的疏水环境中。在脊椎动物的生命过程中， Hb主要起着传输氧的作用。尽管它不具备传递电子的功能，但由于对其结构已有较清楚的认识以及价廉易得，常常被选作探讨生物大分子电化学行为的理想的模型物。然而，由于Hb庞大的分子结构使得其与固体电极之间的直接电子转移较慢，往往要借助媒介体或促进剂 [1]。最近的研究表明，将Hb固载于水凝胶膜[2]、SP Sephadex膜[3]、DNA膜[4]、模拟生物膜[5]，以及利用静电作用而吸附固载于自组装超薄膜中的纳米金表面[6]时， Hb与固体电极之间的电子转移得到了极大的增强，从而在不使用媒介体或促进剂的情况下，可以观察到Hb的直接电化学行为。Hb与电极之间的电子交换在这些膜中和纳米金表面被大大促进据推测是由于蛋白质在这些修饰电极上存在“取向效应”和“隧道效应”。 溶胶-凝胶（Sol-gel）过程条件温和，化学惰性，包埋于Sol-gel中的生物活性物质可以保持其结构、活性和功能，而且小分子可通过Sol-gel的孔道与生物活性物质接触[7]。基于此，我们也曾利用掺杂CTAB的Sol-gel膜[8]、以及单纯的Sol-gel膜[9 ]将Hb固载于碳糊电极表面，成功的观察到了Hb的直接电化学行为，并将该电极发展成为第三代H2O2生物传感器[ 10]作为传感器，其分析的实际样品是复杂的，既有水溶液体系也包含有机介质体系。所以近年来有机相生物传感器的研究越来越受到学术界的关注[11,12]。本文试图研究Hb/Sol-gel修饰的碳糊电极在有机溶剂甲醇、乙睛和正丙醇中的直接电化学和类酶电催化行为。旨在为开发有机相第三代Hb基生物传感器打下基础。 2 实验部分 2.1 所用试剂与仪器 牛血红蛋白（上海伯奥生物科技有限公司），未做进一步纯化处理； 石墨粉（A.R.级，上海化学试剂公司）； 液体石蜡（A.R.级，天津化学试剂有限公司）； 四乙氧基硅烷（A.R.级，上海化学试剂公司）； 各种pH值的0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液（PBS）由0.1mol/L的Na2HPO4和NaH2PO4贮备液按比例混合并在酸度计上用0.1 mmol/L的NaOH和H3PO4调整到所需pH。 实验中所用其它试剂均为分析纯，水为二次蒸馏水。 6200型微机酸度计（中国台湾）； CH660A电化学工作站（上海辰华）； IFS120HR型傅立叶变换红外光谱仪（Bruker公司，德国）。 2.2 实验过程 2.2.1 碳糊电极的制作 将5g石墨粉与3mL液体石蜡混合均匀后，取适量填入玻璃管[4.5mm ( i.d.); 5.5mm ( o.d.)]的一端约5mm的高度，另一端插进一根铜线构成碳糊电极。电极的表面在称量纸上磨光滑。 2.2.2 Sol-gel贮备液的制备 将600μL乙醇、50μL四乙氧基硅烷（TEOS）、10μL5 mmol/L的NaOH溶液以及60μLH2O于一支小试管中快速混合后，置于4℃冰箱中保存备用。这里采用低浓度的5mm/L的NaOH作为催化剂，既可以避免Hb在强碱中变性，又可以使Sol-gel膜能够在适当的时间内形成。 2.2.3 Sol-gel固载Hb 碳糊电极的制作 将7μL Hb的PBS（pH 7.0）溶液（5mgHb溶于200μL的PBS溶液中，并加进5μL甘油）滴到碳糊电极的表面，用一端封口的毛细管涂布均匀；室温凉干1h。然后，将10μL Sol-gel贮备液滴到已被Hb修饰的电极表面并涂布均匀，使其在室温下聚合1h。最后，将制备好的电极浸于pH 7.0的PBS溶液中放置过夜，用缓冲溶液洗去未被固载的Hb后用于实验。当电极不用时，可浸于PBS中冰箱保存。 2.2.4 实验方法 电化学实验在以饱和Ag/AgCl为参比电极，铂丝为辅助电极，Sol