糖尿病视网膜病变神经细胞凋亡及氨基胍对其影响地研究.pdfVIP

材料与方法 颞上、颞下和鼻下四个象限做放射状切开)，95％酒精两次，各12小时，无水酒 精两次，各8小时。 (3)二甲苯透明20一30分钟，浸蜡8一12小时；包埋。将包埋好的眼球标本， 将以平行于视神经矢状轴且以其为平面的视网膜进行连续切片，厚约4um。 4．电镜超微切片的制作及观察 (1)取材及固定：将糖屎病组和治疗组大鼠分别在1、3、6个月全麻后， 0．IM的磷酸盐缓冲液配制4％的多聚甲醛和2．5％戊二醛混合液进行心脏灌流快速 固定后。立即取下大鼠的眼球(保留视神经约2帆，便于夹取)，与角膜缘后0．5mm 沿赤道方向眼球环行剪开，轻轻取出变硬的玻璃体后，将含有视网膜的眼杯放入 2．5％戊二醛固定液，固定2 h，解剖显微镜下取出视网膜，磷酸缓冲液(PH7．2) 冲洗3次，1％四氧化锇后固定2h，双蒸水冲洗3次。 (2)脱水：梯度乙醇脱水，将组织块依次放入30％、50％、70％、80％及90％ 酒精各10分钟，无水酒精中2次，每次10分钟。 (3)浸透与包埋：将脱水后的组织块迅速移入丙酮与包埋剂环氧树脂EPON 812按l：1比例配制的混合液中30分钟，至于38C温箱中：再入丙酮与包埋剂 按1：3比铡配制的混合液中38℃温箱放置2小时，在纯包埋剂中38℃温箱放置 2小时。将组织块置入含有包埋剂的板中，定位后放入衡温箱中聚合，37‘C24 小时，45℃48小时，65℃24小时。 (4)半薄切片定位：将组织块标本切成lum厚的半薄切片，0．5％甲胺蓝溶 液染色后光镜下定位观察。 (5)超薄切片制备：定位后标本修块，应用超薄切片机将样品40—60nm厚 的薄片，用载有Formvar膜的铜网捞片。 (6)染色：用毛细滴管吸取醋酸铀染液滴于蜡盘上，将铜网置于滴液上， 使其切片面向下，染色30分钟。0．IMPBS洗涤3次共lO分钟，滤纸吸去水分。 将柠檬酸铅染液滴于放有固体氢氧化钠的蜡盘上，将铜网置于滴液上，使其切片 面向下，染色30分钟。PBS洗涤3次共10分钟，待自然干燥后行电镜观察。 s透射电镜下观察全层视网膜超微结构的 (7)观察照相：在PhilipsEM208 改变并照相。 5．原位凋亡检测步骤及结果观察 (1)石蜡包埋的切片的预处理常规脱蜡脱水 分钟。或用胃蛋白酶或胰蛋白酶37度孵育15-60分钟。PBS洗2次。 (3)标记：PBS冲洗2次，擦干样品周围的水，滴加50ul的TUNEL反应 混合溶液，在湿盒中37℃孵育60分钟，为防止蒸发和保证TUNEL反应混合物均 匀分布，在反应过程中加盖盖玻片)。PBS冲洗3次。 材料与方法 6．SABC免疫组织化学法检测C-myc，LaminB蛋白的表达 6．1SABC免疫组织化学法检测C-myc蛋白的表达 (1)将石蜡切片捞于预先用APES处理过的载玻片上，60。C温箱烤片过夜： 脱蜡，复水至水； (2)蒸馏水新鲜配制3％H：0：，室温lOmin以灭活内原性酶，蒸馏水洗2min ×3次； (3)滴加复合消化液，室温lOmin，蒸馏水洗2minx3次； (4)滴加正常山羊血清，室温lOmin以封闭非特异抗原，甩去多余液体， 不洗； PBS洗2min×3次； 20min，0．Olmol／L (6)滴加生物素化山羊抗兔IgG，370C PBS洗2minx3 次； (7)滴加试剂SABC，37℃20min，0．Olmol／LPBS洗5min×4次； (8)DAB显色：使用DAB显色试剂盒。取lml蒸馏水，加试剂盒中的A、B、 C液各一滴，混匀后加至切片。室温显色，镜下控制反应时间。蒸馏水洗涤以中 止反应。 (9)苏木素轻度复染，脱水，透明，封片。显微镜下观察。 6，2SABC免疫组织化学法检测LaminB蛋白的表达 (1)将石蜡切片捞于预先用APES处理过的载玻片上，60。0C温箱烤片过夜； 脱蜡，复水至水； (2)蒸馏水新鲜配制3％H：0：，室温lOmin以灭活内原性酶，蒸馏水洗2min ×3次；