中药对溴隐亭致大鼠流产模型蜕膜细胞凋亡影响及其作用机制.pdf

堑．!!：查兰l堕堕竖一!竺塑生兰些丝兰 !堕翌堡堕!塑叁垦堕兰堡型坚堕塑堕型主塑墅堕垦茎笪旦!!型 第一部分溴隐亭致大鼠流产模型的改良及大鼠蜕膜细胞凋亡 的初步观察 前 言 自然流产是早孕期最常见并发症之一，病因多种多样，其中内分泌和免疫 功能紊乱r旨大多数。中医根据“肾主生殖”理论，采用中药补肾益气方，临床疗 效确切，保胎成功率达88％左右。正常妊娠是极为复杂的生理过程，带有父方 异体抗原的胎儿能在母体内维持至妊娠足月分娩而免遭排斥，其中母胎界面的 特殊结构和功能对维持妊娠有重要作用。大量研究表明Th细胞及其分泌的细 胞因子在这一过程中发挥了重要的调控作用，正常妊娠倾向于TI—P．型反应，而 自然流产患者倾向于Thl型反应【l’2，3，屯“。既往我们的研究提示中药能调节妊 娠时Thl和Th2型细胞因子的平衡，纠正内分泌紊乱，从而调节母胎界面免疫 应答，并推测中药可能是通过调节母胎免疫和改善内分泌环境而起到保胎作用 【6’L81，同时我们的研究还观察到在流产患者的蜕膜，INF—n的表达明显高于正 常妊娠者【9】，但对其在母胎界面的具体效应机制则缺乏深入研究。 由于保胎成功患者的蜕膜组织无法取到，为了进一步深入研究中药保胎治 疗的机理，我们在国内首先建立改良的溴隐亭诱发流产SD大鼠模型【6]，其流 产率达75％一80％，并发现该流产模型具有内分泌一免疫功能紊乱的特征，类似 临床上反复自然流产患者低PRL、低P及Thl／Th2的平衡偏向Thl型反应等特 点。以此模型为研究对象，灌服中药保胎成功率达75％一80％，疗效最著。并且 与临床患者类似，应用RT-PCR法在流产大鼠的蜕膜组织中检测到TNF—n mRNA的高表达口]。众多研究表明TNF，与细胞膜表面的相应受体TNF受体 亡信号㈣ll】。近年来，细胞凋亡在妊娠维持中的作用日益受到重视，并成为该 领域的研究热点之一。有资料表明早孕期蜕膜退化是以凋亡的形式发生的{121。 妊娠如要得以继续，蜕膜细胞必须大量凋亡II“，为胚泡发育和胎盘形成提供有 利空间，但蜕膜细胞凋亡有一定的时空限制，如发生异常，可能会影响妊娠的 继续㈣。 本研究进一步改良溴隐亭致SD大鼠流产模型，使其具有较高的稳定性和 可重复性，并初步观察正常妊娠及溴隐亭致流产大鼠蜕膜细胞的凋亡情况。 复曼入学临床博士研究强毕、Ik论文 中药对澳隐亭毁人鼠流产模型蜕膜细胞凋亡的影响及其作用机制 材料和方法 一、材料 ( )实验动物 山中国科学院实验动物中心提供，选择10--12周龄，体重为180～2509 喂食标准大鼠颗粒饲料；同时饲养适当数量的成年雄性大鼠以供雌性大鼠交配。 (二)药品、试剂配制及仪器 制成所需浓度的注射溶液。 和2．49 气灭菌20min。保存于室温。 3．4％的多聚甲醛：取多聚甲醛原液，用PBS配制成4％的多聚甲醛，4。C冰 箱保存。 systems公司。 4．apoTACSTM原位凋亡检测试剂盒：美国RD 5．电子天平：Mettler公司，精确到0．01mg。 6．电热恒温水浴箱：上海医疗器械厂生产。 二、方法 (一)溴隐亭致大鼠流产模型的建立 雌雄大鼠以2：1合笼，次晨起雌鼠每同阴道涂片，以发现阴栓或精子为妊 娠第一天(d1)。孕鼠随机分为四组，每组10只，于妊娠第6～8天每曰皮下注 射溴隐亭O．5 mg／kg·d，0．3 mg／kg·d，妊娠第9天处死 mg／kg·d，0．4 mg／kg·d及0．2 大鼠，观察妊娠结局，计算流产率。以致流产率在70％以上的溴隐亭剂量为最佳 建模剂量，重复实验两次，观察流产模型的稳定性。 (二)标本采集 大鼠经腹腔注射氯胺酮麻醉后，迅速剖腹，剪下子宫置4％多聚甲醛溶液中 固定。 (三)蜕膜细胞凋亡的初步观察 取正常孕鼠与溴隐亭致流产大鼠的妊娠子宫以HE染色和TUNEL染色相结 合法初步观察蜕膜细胞的凋亡情况。 1．HE染色 1)固定：4％多聚甲醛溶液固定。