固定化酶及反应动力学.ppt

* * * * * * * * * 此时相当于将酶集中于反应器的某一部分空间内。因酶浓度与反应速率的正比关系，所以在底物浓度均匀时酶的不均匀分布对总速率无影响。一级动力学底物浓度亦与速率成正比，为何影响总速率？ * ③ 不用载体法 这是选择适当的条件，通过一定处理使酶固定在细胞内的—种方法。如葡萄糖异构酶是一种胞内酶，将生物细胞加热至60℃，10min，其他酶失活，则该酶被固定在细胞内，所以又称加热固定化。又如链霉菌细胞用柠檬酸处理使酶固定在细胞内，若再用壳聚糖处理，使之凝聚干燥即成固定化细胞。 2 辅基与辅酶的固定方法 2.1辅基的固定方法 对于与酶结合牢固的辅基，可以考虑在固定化酶时一般可以将辅基同时固定，但是在一些条件下．如酶蛋白与辅基结合弱而辅基容易泄露时，或者用于亲和层析来分离纯化相应酶等，必须将辅基固定。辅基固定化过程是，将载体与连接臂连接，再以适当反应与辅基连接。裁体应符合以下条件： 没有非专一件吸附，具有多孔性和—定的机械强度；具有适合与臂或辅基结合的功能基团；具有化学和生物学稳定性等.载体大多采用琼脂糖，也使用纤维素、多孔玻璃珠或合成高分子材料等。连接臂，尚需考虑其疏水性、亲水性、离子性和体积、长度等因素。选择偶联反应有两种情况： —是在不影响辅基活性条件下，引入适当的功能基团，如羧基或氨基等容易与载体连接；二是如果辅基分子本身具备有参与催化活性的功能基团，无须再引入功能团。如磷酸吡哆醛(胺)、FAD、FMA、TPP、生物素、硫辛酸、卟啉等，大都利用分子本身原有的功能基团。接着，将具有某种功能团的辅基与连接臂结合，再与活化载体结合.用琼脂糖为载体时．有如下反应： 2.1.1溴化氰法 活化载体可直接与辅基偶联。 2.1.2带羧基载体 2.1.3带氨基载体 2.1.4带巯基或二硫基裁体 2.1.5带芳香氨基线体 2.2辅酶的固定方法 辅酶的固定方法主要有两种：载体结合法和包埋法。载体结合法与捕基固定方法相似，主要用于制备亲和吸附利。包埋法中，由于辅酶相对分子质量小，先将辅酶与水溶性高分子结合，然后再来包埋。这种包埋和酶的包埋法相似。因此，辅酶固定化包括：引入一个功能基团，生成辅酶衍生物，再与水溶性高分子聚合物结合。 2.2.1引入功能基团 对于一些腺苷酸的辅酶，如NAD+、NADP+、CoA和ATP等，在腺嘌呤的第6位或第8位上引入氨基或羧基。其反应分别如下： 2.2.2高分子化 选择高分子化合物时，首先要考虑的是 其溶解度大、分子大小适当，既能保持在半适膜内，又不会过大地增加粘度而影响活性；其次是，高分子大小、结构、亲水性、解离基团、结合量等都影响高分子化辅酶的活性。一般引入羧基的辅酶，用碳二亚胺缩合反应使其与聚Lys、聚乙亚胺结合，形成水溶性高分子化合物；引入氨基的辅酶， 一般用BrCN活化后，再与水溶性多糖类(如右旋糖苷)结合，而高分子化。 酶反应器中，使用高分子辅酶衍生物还有捕酶的再生 问题。一般采用与主反应共组合和独立进行二种方式来解决。如下页图： 在实践中，许多重要的生物活性物质或生化药物的生物合成中，尚需辅酶参加酶反应，所以，辅酶的固定化和固定化辅酶的再生是酶工程的一项重要任务。目前．尚未见用于工业生产的报道。 3 动植物细胞固定化 3.1植物细胞固定化 植物细胞比菌体细胞娇嫩得多，需要温和的固定化方法。80年代开始研究，目前一般采用吸附法和包埋法(下表 )。 3.1.1吸附法 吸附法是将植物细胞吸附在泡沫塑料的孔洞或裂缝内。或吸附于中空纤维外壁上。如将植物细胞定置在中空纤维的外壁与容器内壁之间，培养液及O2在中空维管内流动，透过中空纤维管壁(具半透膜性)，传递给附着于外壁的细胞，细胞代谢产物亦透过外壁随管内培养液流出。利用此法固定的豌豆细胞和胡萝卜细胞进行生产多酚化合物的研究，可连续使用1个多月。又如将洗净、灭茵后的泡沫塑料放进辣椒细胞培养液中，振荡培养一 段时间，细胞吸附于塑料孔洞内，并能生长繁殖。 3.1.2包埋法 包埋法是将植物细胞包埋于琼脂、海藻酸钙、聚丙烯酰胺、明胶和角叉菜胶等多孔凝胶中。 Brodelius等(1979)首次用海藻酸钙包埋制备了固定化长春花细胞、毛地黄细胞、海巴戟细胞。 3.2 动物细胞固定化 动物细胞比菌体细胞、植物细胞更娇嫩．需要最温和的固定化方法。目前,动物细胞固定的方法有吸附法和包埋法两种，其中吸附法用的最多。 3.2.1吸附法 由于大多数动物细胞属于附着细胞，它们在培养过程中趋向于附着固体表面。因此，吸附法特别适合于制备固定化动物细胞。主要载体及固定方法有： (1)转瓶法。转瓶是由玻璃或塑料制成。其表面经一定处理而带有电荷，如用高锰酸钾等氧化剂，强酸、强碱或紫外辐