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项目名称—特异性相互作用毛细管电泳法筛选三七中抗血小板聚集活性成分 申请人：罗曼 刘晶 刘柯利 班级：08级制药工程01班 指导教师:杨丰庆 实验室：学院分配教师个人实验室 立项意义 传统的中药活性成分筛选模式主要是以动物为模型的药理学方法。这种方法虽然能够筛选得到一些活性成分，但有实验成本高、工作量大、周期长、目标不明确、活性成分易丢失等缺点。 鉴于传统筛选方法耗时低效的弊端，人们开始探索新的快速简便的筛选模式。由受体学说得到启示，基于配受体相互作用的药物筛选模式受到了人们的关注。受体学说的核心是，机体存在着接受某一特定药物的特定部位，药物具有高度选择地作用于靶细胞某一特定部位的亲和内在活性，只有既有亲和力，又有内在活性的药物，作用于适应这一药物的特定部位并是结合，才能被激活产生强大生理效应，这一科学论述，透彻地阐明了药物的作用机理。 本课题拟在毛细管电泳中实现复杂中药体系的特异性亲和筛选研究，以期建立一种在线、简单、高效的活性成分筛选方法，为中药活性成分筛选提供新途径。 传统药物筛选的缺点 1.实验繁琐，单体成分多且复杂，耗时 2.实验需要大量活体动物，成本高 3.周期长，目标不明确，活性成分易失 本次实验筛选方法—毛细管电泳法 高效毛细管电泳亦即毛细管电泳（ＣＥ），是一种发展迅猛的新型的分离分析技术，与常用的高效液相色谱法相比，具有分析时间短，分离效率高，适应性广，检测限低，进样量小，溶剂消耗少，自动化程度高等优点，广泛应用于蛋白质、氨基酸、无机离子、有机化合物、药物的分离分析 实验创新点 目前，用于中药活性成分筛选的方法主要有两类： （1）以生物分子作为液相色谱固定相的生物色谱，利用这种方法虽可以得到活性成分的相关信息，但由于色谱柱的制备繁琐且寿命短，使得这种方法难以得到广泛的应用。 （2）离线筛选方法，以细胞膜固相色谱法为代表，这种方法能够保证细胞的完整性和生理活性，但是在操作方面较在线分析而言仍显得繁琐。 本方法集中了以上两类筛选方法的优势，省去了生物色谱柱繁琐的制备过程，在保证了血小板的生理环境的同时能够实现中药活性成分的在线筛选。此方法的建立将会给中药活性成分的筛选提供更加快速、高效的途径。 具备的研究条件 仪器方面，本实验室共有多台自组装毛细管电泳仪以及紫外光谱仪（SHIMADZU）、超声机、离心机、电导仪、电子天平（SHIMADZU）等辅助设备，可满足研究的要求。 本实验室前期开展了大量的配受体相互作用研究，且对复杂体系中的相互作用有初步的探索，此外，本实验前期已对特异性亲和毛细管电泳法的预实验，证明了此方法的可行性。 本项目指导老师具有丰富中药分离提纯和分析检测的经验。 参加本项目的学生具有强烈的求知欲，通过大学二年的基本训练，具有一定的分析问题和解决问题的能力。 预期研究目标 1、建立一种基于特异性相互作用的毛细管电泳在线筛选中药活性成分的方法，将毛细管电泳的作用由分离分析扩大为活性成分的筛选和评价。 2、以三七为对象，血小板为靶分子进行特异性亲和筛选研究，初步确定三七中活血化瘀（抗血小板聚集）的活性物质。 * * * 提取 提取物 提取物 分离 （柱色谱、 制备型HPLC） 多个单体成分 动物体内 注入 活性测试 是否有作用 筛选 有作用成分 三 七 三七，又名田七、人参三七、田三七、山漆等，始载于《本草纲目》。主产于云南、广西及四川地区，为我国名贵中药材。 三七味甘、微苦、性温，无毒，具有活血化瘀、消肿止痛、滋补强壮等功效，是治疗跌打损伤的要药，近年来多用于治疗心脑血管疾病。 基于上述的受体学说，药物要产生效应一般先要与细胞膜上的受体或通道结合。即三七具有抗血小板聚集的作用，其中的活性成分应该能够与血小板上的靶点结合。 具有抗血小板功能的单一西药 与血小板进行实验，建立亲和 毛细管电泳筛选血小板聚集的 方法 研究路线： 不具有抗血小板功能的单一 西药与血小板进行实验，验 证建立方法的可行性 水提取醇沉淀法提取 三七中的活性物质 采用第1项中建立的亲和 毛细管电泳法对三七中 能与血小板发生特异性 相互作用的活性成分进 行筛选。 对筛选得到的成分 进行结构表征，确 定三七中抗血小板 作用活性成分的化 学结构 三七的提取—水提取醇沉淀法 三七超细粉 加水 溶液 醇沉淀 70%-80%乙醇 过滤 小分子水溶性 成分 旋转蒸发仪 除去乙醇 所需三七提取液 冷冻干燥 三七提取物 3-毛细管柱 4-UV检测器 8-色谱图 毛细管电泳设备 CE 动态涂渍 提取物 提取物 血小板 毛细管 A B C D + - 毛细管壁 毛细管筛选物质放大图——未加血小板 电极 A B C D + - 血小板 毛细管壁 毛细管筛选物质放大图——加血小板 电极 A 1min B 2min C 3min