9种实验方法.docVIP

1.建立心肌缺血损伤动物模型 （1）实验动物：大鼠/小鼠 （2）仪器试剂：动物呼吸机，无创缝合针，黑色医用缝合线、10ml一次性无菌注射器， 各种手术器械（如止血钳、小无齿弯钳、小镊，小眼科剪等），异戊巴比妥注射液 （3）实验方法：称量大鼠体重，计算给予麻醉剂的剂量，腹腔注射麻醉后，仰卧位固定于手术台上。插气管接人工呼吸机，胸部去毛，用酒精棉消毒。沿着锁骨中线纵行切开皮肤2cm，在第三或第四肋间用止血钳逐层游离皮下组织、肌肉，打开胸腔，可清晰看到心脏搏动的暗影，剪开心包，在动脉圆锥与左心耳之间，左心耳下缘约 3mm处结扎左冠状动脉前降支实行心肌缺血，30min后解开结扎线，将心脏送回胸腔，用医用缝合线缝合。 2.原代心肌细胞及骨髓间充质干细胞分离培养及细胞缺氧模型的建立 【原代心肌细胞分离培养】 （1）实验动物：乳鼠 （2）仪器试剂：无菌器械盒（小烧杯、滤网、平皿、剪刀、直镊、弯镊），离心管，吸管，移液枪，冰袋，37 ℃恒温水浴箱，37 ℃、5%CO2孵箱，离心机 （3）实验方法：乳鼠，雌雄不分，75%酒精消毒皮肤后，在无菌的条件下，经断头、开胸取得心脏。洗净残血，剪去多余组织再将其剪碎至2mm3大小的组织块，加入相当于组织块2倍体积的0.25%胰蛋白酶，消化，弃去第一次消化液。继续消化，将上清液放到10ml离心管中，加入等量含体积分数10%胎牛血清的低糖培养液以终止消化，重复该步骤，直到沉淀完全消失为止。细胞悬液经200目筛网过滤至冰上的小烧杯中，滤液平均分装到离心管中，4℃、2500rpm离心3min，弃去上清。用培养液将细胞沉淀吹散，使之重悬。差速贴壁2h，将心肌细胞吸出移至另一培养瓶中培养。48h后换液。 【骨髓间充质干细胞分离培养】 将大鼠颈椎脱臼处死后，置于75 %酒精浸泡约5 min，移入超净工作台于无菌条件下分离出大鼠的股骨和胫骨，剪去股骨、胫骨骨髁，暴露骨髓腔。用1mL注射器吸取BMSCs专用培养液反复冲洗骨髓腔，冲出骨髓细胞后，经吹打制成单细胞悬液，以1×106/mL密度接种于30 ml培养瓶中，在5% CO2饱和湿度、37 ℃培养箱中进行原代培养，3天后更换新鲜培养液，去除未贴壁细胞，换液后每日于倒置显微镜下观察细胞生长情况及形态特征，此后视细胞生长速度每2～3天更换新鲜培养液。 【细胞缺氧模型的建立】 取体外培养的细胞，置于通入体积分数为5%CO2和95%N2的有机玻璃盒中继续缺氧培养一段时间（15min）。可用观察细胞形态比色试验检测细胞的。心脏功能检查方法很多，通常分为有创性和无创性两大类。有创性检查主要指心导管检查；无创性检查方法较多，如超声心动图、放射性核素心血管造影、收缩时间间期、心阻抗图等等。而现今以无创性方法较常用，超声心动图是目前应用最为广泛地无创伤性心功能检查方法。超声心图可以测定心脏在不同时相或不同心动周期地心腔内径变化，计算心腔地容量改变，结合其他生理参数推算心脏地收缩和舒张功能；可以测量通过某一断面地血流速度，推算心脏射血量；还可测量时间间接反应心脏功能。经过大量地临床和动物试验研究证明，用超声心动图测定地心脏功能是准确可靠地。但需要注意一般超声测定地心功能指标多反应左心功能，因为右室形状地特点，超声测量其容量常常比较困难，现在用超声测定右室功能仍处在研究阶段。心电图描记方法在体表任何两处安放电极板，用导线接到心电图机的正负两极，即形成导联，可借以记录人体两处的心电电位差。常规用12个导联。标准导联又称双极导联,在三个肢体上安置电极，并假设这三点在同一平面上形成一个等边三角形，而心脏产生的综合电力是一个位于此等边三角形中心的电偶。单极肢导即把三个肢体互相连通构成中心电端，在肢体通向中心电端间加一个5000Ω的电阻，中心电端电位接近于零，因此被看作无干电极，探查电极分别置各肢体形成单极肢导。可以用于计算心肌梗方法摘取心脏,用生理盐水冲洗,除去血污,将心脏切成0. 1～0. 3 cm厚的心肌片,用2片新鲜心肌横断面进行NBT染色,37 温孵15 min,梗死心肌不着色,正常心肌染成蓝色,用CIMA2400图像分析仪测量心肌梗死面积和整个心肌横断面面积,计算心肌梗死部分占心肌横断面面积的百分比。2）由上述取下的左心室从心底部开始约每间隔2mm 切一片,将左心室平均切成5～6片 。每片标本常规脱水、透明后石蜡包埋,均水平包埋,心尖方向一面朝向包埋框底部。每片标本切片一张,HE 染色。在图像分析仪(OPTON VIDS21 ,西德) 上分析各个截面的梗塞面积、心腔半径、室间隔厚度。各项数据均用算术均数±标准差( X ±SD) 表示,显著性检验采用t 检验。3）取出心脏，盐水冲洗，剔除脂肪，血管等组织，并沿冠状沟切除心房，右心室，仅留下左心室肌称重，然后将心室切成0.1cm厚的心肌片,将其