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酶学复习重点： 酶的基础研究：（重点） 辅因子催化机理：PLP 磷酸吡哆醛（PLP）是转氨酶与氨基酸脱羧酶的辅酶，它对蛋白质代谢具有十分重要的意义。所有转氨酶都含磷酸吡哆醛，与每一个牢固非共价键相连。磷酸吡哆醛PLP在氨基酸代谢中起重要作用：氨基转移酶（转氨酶），脱羧酶，消旋酶。 共轭双系统将吡啶环和底物连接，带正电的氮原子趋向于从氨基酸的Cα吸取电子，消弱Cα和R，H和COO—的结合，这个亲电催化的结果，可使第三个键的任何一个裂开形成负离子，又被共个系统所稳定。 1.氨基酸消旋酶：氨基酸消旋酶催化单一的立体异构体形式转变为D-或L-立体异构体消旋混合物。PLP以希夫碱键合于酶的Lys侧链氨基，并以磷酸负电荷和酶的正电荷基团静电键合。当氨基酸底物和酶结合时，希夫碱的碳原子受到底物α-氨基的亲核攻击，PLP的底物形成新的希夫碱键合，在这个配合物中已消弱的Cα-H键被裂开（亲电催化结果）释放一个质子，整个过程是可逆的。因此，质子可加于配合物，重新形成游离的氨基酸。质子起始的丢失导致Cα不对称的丧失，所以，重新产生的氨基酸未必是开始时存在的同样立体异构体。 2.氨基转移酶：从希夫碱形成到质子丢失的各个反应同上，产生的配合物在不同部位受到H+攻击，再经水解，形成磷酸吡哆胺同时释放酮酸。 从一个不同的酮酸对磷酸吡哆胺攻击开始，可发生逆向反映，形成不同于起始存在的氨基酸。二步反应可表示为： L-Glu+E-PLP酮戊二酸+E-PMP Oxa+E-PMPL-Asp+E-PLP 酶活性中心的鉴定方法（其中动力学分析法的具体细节掌握大概标题即可） 酶是生物大分子物质，分子量至少10000以上，但只有少数一些氨基酸残基和催化活力 有关，这些特异的氨基酸残基组成了酶的活性中心。 酶活性中心存在的实验证据： ①从抑制剂的作用推测：DFP（二异丙基氟磷酸）与胰凝乳蛋白酶的Ser-195的羟基反应，不可逆抑制剂增加一倍，酶作用减少一倍。 ②从酶与底物的作用证实：胰凝乳蛋白酶作用于对硝基苯酚乙酸酯，颜色深浅反应酶活性。 酶的活性部位：是指酶分子中与催化功能直接有关的氨基酸按照特定立体构象组成的活 性结构：1 酶分子上少数几个氨基酸残基组成，由肽链的盘绕折叠而成； 2 辅酶也是活性部位的重要组成部位； 3 多底物酶可能是由几个亚基组成的寡聚酶。 催化部位：在催化反应中直接参与电子收受关系的部位，直接参与催化， 酶活性中心 底物敏感键在此被切断或形成新键，并形成底物 底物结合部位：指与底物特异结合的有关部位，也叫特异性决定部位。 酶活性中心的研究技术： 化学修饰法。（最经典） 使用非特异性试剂（不能区分活性部位内和活性部位外基团）。特殊基团：某些酶的活性部位含有活性部位以外没有的氨基酸残基。对于非特殊基团，要充分利用活性部位中某一基团具有特别高的反应性的有利条件进行化学修饰。（如DFP与胰凝乳蛋白酶的Ser-195的羟基反应） 判断标准： (1).底物保护实验：对照试验。加底物/抑制剂，再加修饰剂；移除底物，酶去催化，若有活性，底物起保护作用，若无活性，则说明活性中心外修饰液可以使其失活。 （活性中心失活程度与修饰剂浓度正相关） .计量关系：邹氏作图法。a=xie a是作用过程剩余的具有全部活力的酶分子的分数（活力剩余分数），xe代表其必需基团剩余分数，i是必需基团数目。 修饰基团仅作用于一类基团，其中必须基团与非必须基团作用速度相等。 动力学分析法 实验方法 所得信息 改变底物浓度（对单底物不适用） 反应络合物顺序，区别可能的机制 改变底物结构 结合部位和催化部位的结构特点，即活性部位图解 可逆抑制 利用竞争性抑制剂了解活性部位 改变pH 催化部位氨基酸的pKa由此推测催化部位可能拥有的氨基酸 恒态前动力学研究 检测酶中间络合物和基元反应速度常数 3.生物信息学 上网搜索，寻找保守区 4.定点突变法DNA shuffling（引物突变设计，重叠延伸PCR，一步反向PCR） 指改变酶分子上特定位置的残基，观察酶结构和功能的的变化，从而了解该位点的侧链基团在酶的结构和功能上的作用。随机突变：易错PCR，组合活性中心饱和突变，DNA shuffling。 X射线衍射法 基团的相对位置和实际状态。 Domain联合分析 最令人信服，但一种方法往往不能解决问题。 酶的柔性 诱导契合假说：当酶分子与底物接近时，酶蛋白与底物结合并不是底物与活性部位的密切互补匹配