Pseudomonas aeruginosa脂肪氧合酶的分泌表达及热稳定性改造.pdfVIP

摘 要 摘 要 脂肪氧合酶(Lipoxygenase, EC2, LOX)是一类含有非血红素铁，能够专一催 化氧化含有 cis,cis-1,4-戊二烯结构的多元不饱和脂肪酸，形成具有共轭双键的脂肪酸氢 过氧化物。LOX 在食品工业、医药工业和化工领域具有广泛的应用，市场需求巨大。 因此，LOX 的生产在国内外受到高度关注。真核LOX 相关研究较多，但至今未实现工 业化生产，主要原因是真核 LOX 稳定性较差且难以在异源宿主中分泌表达。目前，国 内外对于细菌 LOX 分泌表达与分子改造的研究报道较少，本文将来源于铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa) 的LOX 基因在大肠杆菌(Escherichia coli) Rosetta (DE3) 中进行 分泌表达，并对重组酶进行了性质分析和热稳定性改造。主要结果如下： (1) P. aeruginosa LOX 在E. coli 中的分泌表达和发酵优化 基于NCBI 数据库信息，通过PCR 克隆得到P. aeruginosa LOX 基因。将上述带有 天然信号肽的LOX 基因克隆至表达载体pET-22b(+) ，并在E. coli 中分泌表达。确定重 组菌摇瓶发酵的较优条件为：TB 培养基(诱导时添加0.5% (v/v)吐温-20) 、1 mmol/L 诱导 剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、诱导起始菌体密度(OD600)0.6 、20 ℃诱导。重组菌 在该条件下诱导50 h，胞外酶活达到8.5 U/mL。确定重组菌3L 罐发酵的较优条件为： TB 培养基(诱导时添加0.5% (w/v)SDS) 、1 mmol/L IPTG、20 ℃诱导、诱导起始菌体密度 (OD600)8 。在该条件下诱导48 h ，胞外酶活可以达到8.0 U/mL。这是目前发酵法生产LOX 的胞外最高产量。 (2) 重组LOX 的分离纯化和酶学性质分析 依次经过硫酸铵沉淀、透析、Q Sepharose High Performance 阴离子交换色谱、Mono Q 阴离子交换色谱，从重组E. coli 发酵液中纯化得到电泳纯的LOX ，比酶活由2.1 U/mg 提高至28.3 U/mg ，纯化倍数为13.5，回收率为10%。重组LOX 的最适反应温度为25 ℃， 在50℃、60℃下酶活半衰期分别为10 min 和4.5 min ；最适反应pH 为7.5，在pH 6.5-7.5 范围内能够保持80% 以上的酶活；其Km 和Kcat 值分别为48.9 μmol/L 和23.5 1/s ；常见 二价金属离子对酶活均有不同程度的抑制作用，但二十碳四烯酸(ETYA)对酶活没有任何 影响；重组 LOX 催化氧化亚油酸产生的脂肪酸氢过氧化物(HPOD) 中主要成分为 13(S)-HPOD 。 (3) 缺失N 末端高柔性loop 提高LOX 热稳定性 通过分段缺失重组LOX N 端高柔性区域，在未影响催化效率的前提下提高了酶的 热稳定性。其中，缺失N 端前 10 个氨基酸对酶学性质没有显著影响，但进一步缺失前 20 和30 个氨基酸可使LOX 在50℃下的半衰期分别提高1.3 倍和2.1 倍，同时比酶活保 持了 90% 以上。而进一步缺失N 末端氨基酸会导致重组酶形成包涵体，表明 Ile49 和 Leu59 之间的10 个氨基酸是LOX 在E. coli 中正确折叠所必须的。圆二色谱及荧光光谱 分析表明，所有突变体的二级、三级结构都没有明显的变化，但表面疏水性均有所降低， 这可能也是突变体D20 ，D30 比酶活降低、热稳定性提高的原因之一。 (4) 改造分子内部高柔性loop 提高LOX 热稳定性 I 分别通过突变、替换和缺失等策略降低“盖子”结构铰链loop 的柔性，以提高LOX 热稳定性。其中，将Gly201 、Gly206 分别及同时突变为Pro 使重组LOX 在50℃下的半 衰期分别提高了0.4、0.6 和1.0 倍；用PT linker 替换L6 loop ，使得LOX 在50℃下的半 衰期提高了3.5 倍；上述突变体比酶活均保持在85% 以上。但缺失L6 loop 使得LOX 的 比酶活和热定性分别降低了94%和75% 。圆二色谱及荧