shRNA表达对细胞内miRNA及其生成因子的影响.pdfVIP

  中文摘要 shRNA 表达对细胞内 miRNA 及其生成因子的影响 RNA 干扰最早是在线虫中发现的一种由双链 RNA 引发的基因沉默现象，后来的研究证 实不论是长的双链 RNA(dsRNA)或小发夹 RNA(shRNA) ，最后都要被 Dicer 加工成 21 个碱 基长度的功能性双链小干扰 RNA—siRNA 。随着对线虫发育调控的进一步研究，人们又发 现了一种新的内源功能性双链 RNA 分子—microRNA(miRNA) ，成熟的 miRNA 结合于 Argonaute(Ago)蛋白引起靶 mRNA 的降解。siRNA 与 miRNA 有着类似的生产途径和功能， 而定义上的区别主要在于它们的来源不同：通常 siRNA 由外源引入，而miRNA 由基因组编 码并转录产生。 目前RNAi 技术已广泛地用于抗病毒及癌症等研究中，并已取得了一些重大进展。然而 RNAi 的应用也遇到一些挑战，如脱靶效应、非特异免疫应答反应、细胞通路紊乱，以及致 死性等毒副作用。RNAi 的脱靶效应广泛存在，并能使机体产生毒性表型。另外由于 siRNA 与病毒结构相似而容易引起非特异性免疫应答干扰素效应。由于高表达 siRNA 可能导致內 源 miRNA 表达变化而引起 miRNA 细胞通路异常，甚至 siRNA 过表达对转基因动物有致死 性的威胁。 为了探究外源 siRNA 的过表达对 miRNA 加工转运相关细胞组分及早期胚胎发育的 影响，本研究利用非脂质体转染法，经过 450μg/mLG-418 药物抗性筛选以及间接荧光免疫 （IFA ）法检测，获得了4 种（shRNA-N1， shRNA-N2 ， shRNA-NS3-2 ， shRNA-NS5B ） 高表达不同类型 shRNA 的猪胎儿成纤维细胞。提取获得的表达不同类型 shRNA 的猪胎儿成 纤维细胞的总 RNA ，用Realtime PCR 法检测细胞內源干扰素反应效应基因 IFN-β及 OAS1 的表达量，结果显示IFN-β及 OAS1 在 mRNA 水平的表达量均有显著升高（P0.05 ），说明 高表达 shRNA 诱导细胞产生了干扰素反应。同时利用 Realtime PCR 对不同类型成纤维细胞 中小 RNA 形成剪切工具酶 Dicer 和 Drosha 的 mRNA 表达量进行检测，结果表明两种工具 酶的 mRNA 表达量均有所升高（P0.05 ）。提取高表达不同类型 shRNA 的猪胎儿成纤维细 胞的小 RNA ，使用Realtime PCR 方法对细胞内部分 miRNA 进行检测，结果发现前体 mir-21 和 mir-196 的表达量显著升高（P0.05 ），基于 miRNA 和两种剪切酶 mRNA 表达量都升高 的事实，推测 shRAN 高表达扰乱了细胞内源正常的 miRNA 通路而可能对细胞的生长产生 不良影响。实验继续将稳定表达 shRNA 的猪胎儿成纤维细胞进行体细胞核移植，观察统计 实验组和对照组的囊胚形成率，结果实验组与对照组二者没有显著差异，推测 shRNA 高表 达对囊胚初期形成的影响不明显。在高表达 shRNA 转基因猪中，高表达的 shRNA 竞争使 用 miRNA 加工运输和发挥功能的细胞组分，影响体内正常 miRNA 的成熟和行使功能， I   从而影响猪的生成发育，可能是造成 shRNA 转基因猪低出生率低和高死亡率原因之一。 关键词： shRNA，干扰素反应，miRNA ，胚胎发育，副作用 II