Sphingopyxis sp.113P3聚乙烯醇脱氢酶的异源高效表达研究.pdfVIP

摘 要 摘 要 聚乙烯醇（PVA ）主要以 1,3-二醇键的化学结构存在，是一种难于被降解的高分子 化合物。PVA 具有很多优良性能，在工业上得到广泛应用。然而，大量 PVA 废水排放 到环境，导致严重的污染，因此，实现 PVA 的生物降解具有重要的现实意义。PVA 脱 氢酶（PVADH ）催化 PVA 降解的第一步反应，本论文以 Sphingopyxis sp. 113P3 PVADH 为研究对象，详细研究该酶基因在大肠杆菌（E. coli ）和毕赤酵母（P. pastoris ）中的表 达情况，并对该酶的应用进行初步研究，具体研究内容如下： （1）Sphingopyxis sp. 113P3聚乙烯醇脱氢酶基因 （PVADH ）的人工合成及在大肠杆 菌（E. coli ）中的融合表达与包涵体复性。以Sphingopyxis sp. 113P3 PVADH的氨基酸序 列为模板，按P. pastoris密码子偏好性并替换掉E. coli稀有密码子，合成1965 bp的基因序 列。聚合酶链式反应（PCR ）扩增1887 bp的成熟酶基因（mPVADH ），并插入质粒pET32a(+) ， o 转化E. coli BL21 (DE3) 。以20 C、0.05 mM 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 （IPTG ）、2%葡 萄糖条件，诱导12 h，目的蛋白仍以包涵体存在。通过包涵体复溶、稀释复性、重组肠 激酶（rEK ）切割、透析去除rEK和硫氧还蛋白（TrxA ），纯化得到约67 kDa的mPVADH 蛋白，酶活和比酶活分别为60 U/mL和109 U/mg。 （2 ）成熟PVADH在毕赤酵母（P. pastoris ）中的高效表达、纯化和酶学性质研究。 将mPVADH基因插入载体pPIC9K并电转化P. pastoris GS115，高拷贝转化子在摇瓶和3L 发酵罐最高酶活分别为56和902 U/mL，是首次在真核表达系统中成功表达PVADH 。但 是，表达的 目的蛋白分子量小于预期，N-端氨基酸测序表明截短蛋白缺少mPVADH 的 o 2+ 1-81氨基酸。纯化的截短酶最适反应温度和pH分别为41-53 C和pH7.0-8.0；Ca 对酶活有 促进作用；催化最适底物 （PVA 1799 ）的米氏常数（Km ）和最大反应速率（Vmax ）分 别是1.87 mg/mL和34.9 nmol/(min ·mg) 。 （3 ）成熟 PVADH 在P. pastoris 中截短表达分析。P. pastoris GS115/pPIC9K/mPVADH 摇瓶诱导时，分别添加 1%酪蛋白氨基酸、5 g/L 六偏磷酸钠；或将质粒 pPIC9K/mPVADH 转化 P. pastoris SMD1168，表达的目的蛋白是截短的，说明不是胞外蛋白酶将目的蛋白 降解。反转录 PCR （RT-PCR ）表明 mPVADH 转录时的 mRNA 是全长的，说明转录正 确。分别缺失 mPVADH 截断位点前的 ATG59 、ATG64 、ATG67 和 ATG76 ；或缺失mPVADH 蛋白 N 端的 1-2 1、22-51 和 52-81 氨基酸，各突变转化子表达的 目的蛋白仍然是截短的。 同时，将绿色荧光蛋白（EGFP ）与mPVADH 融合，所得突变转化子表达的 2 段外源蛋 白的分子量分别与 EGFP 和截短 PVADH 相当，说明融合蛋白翻译完整，但胞内蛋白酶 将其错误切割。为了确定胞内蛋白酶对 mPVADH 的识别位点，首先针对蛋白酶 Kex2 的识别位点设计突变；然后针对其它蛋白酶，将 mPVADH 截断位点附近的氨基酸突变 为(GlyGlyGlyGlySer) ，或缺失截断位点-5 至+5 的氨基酸序列，突变转化子表达的都是 2 截短蛋白，说明不是 Kex2 错切 mPVADH ，该蛋白酶识别 mPVADH 的位点可能在截断 位点后某区域，还有待于进一步研究。 （4 ）截短PVADH （tPVADH ）在P. pastoris 中的过量表达与相关机