Thermobifida fusca内切β-1，4-葡聚糖酶的克隆表达及应用研究.pdfVIP

摘 要 摘 要 内切β- 1,4-葡聚糖酶 (EC3.2.1.4)，又名内切纤维素酶，是纤维素酶系中的重要组 成部分，能随机水解纤维素的β- 1, 4-葡萄糖苷键，产生纤维低聚糖，目前广泛应用于 饲料、食品、纺织和洗涤等工业。此外，内切纤维素酶可以非专一性水解壳聚糖，生 成功能性低聚糖——壳寡糖(Chitosan oligosaccharides, COS) 。 本研究主要对Thermobifida fusca 内切β- 1,4-葡聚糖酶Cel5A 进行克隆，并在大肠 杆菌宿主中表达，研究了重组酶的酶学性质，并利用重组酶进行壳寡糖的制备。主要 研究结果如下： (1) 实现了Cel5A 在大肠杆菌中的克隆表达。将来源于T. fusca 的内切β- 1, 4-葡聚 糖酶Cel5A，以T. fusca 基因组DNA 为模板，通过PCR 的方法成功扩增，获得全长 1293 bp 的cel5A 基因。构建了重组表达质粒pET-24a(+)/pelB-cel5A ，并将其转化宿主 菌E. coli BL21 (DE3) 。重组菌在TB 培养基中发酵48 h 后，胞外酶活为46.8 IU/mL。 (2) 在摇瓶及3L 罐水平上对重组菌的发酵培养进行研究。优化后的摇瓶发酵培养 基为甘油16 g/L，酵母粉45 g/L，磷酸盐 30 mmol/L，Mg2+ 4 mmol/L，胞外酶活为72.6 IU/mL，相对于优化前提升了55%左右。在此基础上，将重组菌在3 L 发酵罐上进行 了小试实验，酶外酶活最高达到172.8 IU/mL，总酶活(胞外酶活与周质空间酶活之和) 为656.6 IU/mL ，生产强度达到18.8 IU/ (mL·h) ，分别是TB 摇瓶发酵的14 倍和19 倍， 是重组S. lividans 的82 倍，为现有报道T. fusca 来源Cel5A 酶活的最高水平。 (3) 将重组Cel5A 进行分离纯化，并研究了重组Cel5A 的相关酶学性质。经过硫 酸铵盐析、阴离子层析和凝胶层析后得到电泳纯的重组酶液，并研究了重组酶的酶学 性质。重组酶的最适温度为80℃，在50℃和60℃下均具有良好的热稳定性；重组酶 的最适pH 为5.5， pH 稳定范围较宽；Ca2+等金属离子对重组酶未见有明显的激活与 抑制作用；在50℃，pH 5.5 条件下，以CMC 为底物，K m 和 Vmax 分别为5.1 mg/mL 和48.7 IU/mg；重组Cel5A 在洗涤剂常用的表面活性剂中具有良好的稳定性，通过 PyMOL 软件对重组Cel5A 的催化结构域进行了表面静电势分析，推测了其在表面活 性剂环境中稳定的分子基础。 (4) 考察了重组Cel5A 水解壳聚糖制备壳寡糖的效果。通过对酶解液的质谱分析 确定了重组Cel5A 具有水解壳聚糖制备壳寡糖的能力，初步建立了利用HPLC-ELSD 法分离检测壳寡糖产物的方法。确定了重组Cel5A 水解壳聚糖的最优条件为底物浓度 30 g/L，温度50℃，加酶量2 IU/g 底物，反应1 h，可获得聚合度为3~8 的壳寡糖， 转化率为60.3%。 关键词：内切β- 1,4-葡聚糖酶；大肠杆菌；克隆表达；发酵优化；壳寡糖 I Abstract Abstract Endo-β- 1, 4-glucanase (EC3.2.1.4), one major type of cellulase, cleaves the cellulose at random β- 1, 4 linkages and releases cello-oligosaccharides. It has been found to catalyze chitosan hydrolysis effectively to produce chitosan oligosaccharides. In the present study, Ther