NDPK B稳定表达细胞系的建立及其对不同源NDV复制的影响.pdfVIP

中文摘要 NDPK B 稳定表达细胞系的建立及其对不同源新城疫病毒复制的影响 新城疫是一种急性、高度传染性及败血性疾病，由新城疫病毒引起，可以感 染鸡、火鸡等多种禽类。新城疫可以给世界养禽业带来巨大的经济损失，我国农 业部将新城疫列为一类动物传染病，目前，其仍然是危害养禽业最重要的传染病 之一。 目前，虽然对新城疫病毒粒子结构蛋白的功能有相对清晰的了解和认识，但 是有关新城疫病毒感染和致病的机理还不十分清楚，特别是在新城疫病毒与细胞 之间相互作用机制方面的研究报道还相对较少。病毒感染细胞的过程，是病毒基 因组在细胞内进行自我复制，病毒相关基因进行转录、表达过程的积累，也是病 毒和宿主相互作用的综合表现。本项目将不同源 NDV 分别感染 CEF 细胞(鸡胚 成纤维细胞) ，利用蛋白质组学技术和方法，通过对病毒未感染与感染的 CEF 细 胞全蛋白差异蛋白比较和质谱鉴定，得到了一些在病毒感染前后蛋白量发生变 化，推测可能与新城疫病毒的感染机制相关的宿主蛋白。因此，研究病毒如何感 染宿主，以及病毒感染后对宿主造成的影响，蛋白质组学方法是最为直观的策略 之一。核苷二磷酸激酶 B(NDPK B)为本项目鉴定出的差异蛋白之一。有关研究 表明，核苷二磷酸激酶 B 能够参与介导细胞凋亡，在调节凋亡过程中发挥着重 要作用，并且与其它调节细胞凋亡的途径一起，通过增强细胞自身的免疫机制， 清除受损伤的细胞，例如肿瘤细胞或病毒感染的细胞。目前，国际国内对鸡源蛋 白特别是NDPK B 蛋白的研究报道还相对较少。 因此，为了对鸡 NDPK B 蛋白的生物学功能进行深入研究，本研究构建了 携带有绿色荧光蛋白(GFP) 标记分子和 G418 筛选位点的真核表达质粒 pEGFP-NDPK B ，并将其转染Vero 细胞后，利用 RT-PCR 、倒置荧光显微镜观察 以及Western blot 分析，鉴定了 NDPK B-GFP 融合蛋白的表达；并通过 MTT 实 验方法研究了 NDPK B 蛋白表达对细胞生长活性的影响，实验结果表明，NDPK B 能够显著抑制 Vero 细胞、结肠癌细胞(SW1116)和肺癌细胞(A549)的生长。 随后，通过生物信息学工具对 NDPK B 蛋白进行分析预测，结果显示，NDPK B 蛋白共由 153 个氨基酸组成，分子量为 17.29kDa，理论等电点 (PI) 为 7.73， 理论分子式为 C H N O S ；该蛋白在细胞内的半衰期是 30 hours 777 1216 212 219 8 I (mammalian reticulocytes, in vitro) 。平均疏水性分析显示约有一个峰值，位于60-80 个氨基酸之间。跨膜区和信号肽预测分析表明，NDPK B 蛋白中不存在跨膜螺旋 区，也没有信号肽。活性位点预测显示，第 116-124 位氨基酸残基为其活性区域， 第 119 位为磷酸组氨酸活性位点。二级结构预测显示，NDPK B 蛋白包含 10 个 α 螺旋和 3 个 β折叠。 之后，本研究构建了稳定表达 NDPK B 蛋白的 Vero/NDPK B 细胞系，在此 基础上，探索 NDPK B 蛋白对 NA-1 株、F48E9 株 NDV 复制的影响，结果表明， NDPK B 蛋白表达能够抑制 NA-1 株、F48E9 株 NDV 在 Vero 细胞中的复制。本 研究从生物学功能上初步阐述了NDPK B 蛋白在NDV 感染复制和增殖过程中的 作用，为以后对 NDV 感染的分子机理进行深入研究奠定了基础。 关键词： 新城疫病毒；核苷二磷酸激酶 B ；真核表达；细胞增殖；生物信息学；复制 II Abstract Researches on the const