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一株高致死性鸡痘病毒的全基因序列的测定及初步分析 Sequencing and preliminary analysis of a high lethality Fowlpox virus 作者姓名：周 平 专业名称：基础兽医学 指导教师：高 丰 教授 学位类别：农学硕士 论文答辩日期：2013 年 6 月 6 日 中文摘要 一株高致死性鸡痘病毒的全基因序列的测定及初步分析 鸡痘是由鸡痘病毒（Fowlpox virus ，FPV ）引起的一种接触性传染病，能够 感染不同品种和日龄的鸡，但是对雏鸡的易感性最高。FPV 感染鸡只在临床上主 要表现为皮肤型、黏膜型以及混合型 3 种类型。最常见的类型为皮肤型，该型以 上皮增生、在皮肤及少毛处出现痘疹为主要特征。其次为黏膜型，俗称“鸡白喉”， 主要表现为口腔、咽、喉和气管黏膜处形成突出的小结节，之后形成较大的溃疡 面，病鸡通常会因呼吸困难而窒息死亡。虽然 FPV 的致死率不高，但极易引起 其它病原的继发感染，导致病鸡消瘦、生长缓慢以及生产性能下降，从而给养禽 业带来严重的损失。目前世界范围内通过接种 FPV 疫苗已经很好的控制了 FPV 的传播。然而，近年来，该病又以新的形式爆发，威胁着养禽业的发展，这主要 是由于 FPV 基因组的变异以及与其它病毒的重组现象的发生，导致免疫失败而 引发鸡痘病毒感染的报道不断增多，给 FPV 的预防和治疗带来了新的挑战。 2009年，吉林省某大型鸡场的1万多只褐种蛋鸡发生了大批量的死亡。病死 鸡在临床上表现为鸡冠以及背部皮肤处有大量的结节状痘疹。本实验室根据临床 症状以及实验室分析，确诊该起病例是由FPV引起的，且该FPV与禽网状内皮增 生病病毒（Reticuloendotheliosis Virus ，REV ）发生了病毒重组，FPV基因组中插 入了REV 的片段，经SPF鸡胚绒毛尿囊膜接种法,我们成功获得一株鸡痘病毒。将 分离的病毒感染不同日龄的SPF鸡，感染鸡只均表现出与自然感染病例相似的临 床症状，而且发病率高达100%，致死率高达90% 以上，证实分离获得的病毒为 整合有REV片段的高致死性皮肤型鸡痘病毒，并将该分离株命名为FPV/JL/09/C2 株。在此基础上，利用原代鸡胚成纤维细胞（Chicken embryo fibroblasts，CEF ） 对FPV/JL/09/C2毒株进行增殖，并对其在CEF上增殖动态变化规律进行研究。本 试验针对FPV4b核心蛋白基因序列设计了1对特异性引物，建立了用于检测FPV 的SYBR Green I Real-Time PCR方法，并对CEF培养12 h、24 h 、48 h 、72 h、96 h 的病毒液分别进行定量检测。结果表明：建立的标准曲线线性关系良好，线性回 归方程为y=-3.335x+50.212 ，相关系数为r2=0.944 ，融解峰单一，检测灵敏度可以 I 2 达到10 copies/μL ；与新城疫病毒（Newcastle disease virus ，NDV ）、马立克氏病 毒（Marek’s disease virus ，MDV ）等不发生交叉反应，特异性良好；组内变异系 数均小于2% ，组间变异系数均小于3%，同一模板浓度的Ct值相对稳定，重复性 好。在感染后72 h病毒含量达到高峰，从而确定出最佳的收毒时间为72 h 。上述 试验结果显示，本研究所建立的Real-Time荧光定量PCR检测方法具有特异性强、 灵敏度高、重复性好等优点，可用于FPV 的定量及定性检测。 为了找出变异基因，并进而阐明FPV/JL/09/C2毒株毒力增强的原因，本研究 对其进行Illumina高通量测序，经测序、拼接后基因组全长为298638 bp ，编码242 个开放阅读框（Open reading frame，ORF ），G+C含量为31.44% 。将FPV/JL/09/C2 毒株基因（ORFs ）与参考毒株AF198100进行