亚油酸异构酶基因在产油真菌中的异源表达及产物的生物合成.pdfVIP

摘 要 共轭亚油酸（Conjugated linoleic acid，CLA ）是具有共轭双键的十八碳二烯酸的统 称，由于其多样的生理活性而受到广泛关注。为了满足 CLA 在医药及营养领域的应用 需求，通过生物技术生产单一、安全的 CLA 活性异构单体成为 CLA 合成技术的发展趋 势。本论文将来源于痤疮丙酸杆菌（Propionibacterium acnes ）的亚油酸异构酶（PAI ） 基因分别在大肠杆菌（Escherichia coli ）、高山被孢霉（Mortierella alpina ）和耶氏解脂 酵母（Yarrowia lipolytica）中进行异源表达，确定耶氏解脂酵母作为合适的 trans-10， cis- 12-CLA 生物合成系统，在此基础上，通过基因工程手段构建了一株 trans-10， cis- 12-CLA 的高产菌株，并对发酵条件进行初步优化，进一步提高 CLA 产量。论文的 主要研究结果如下： (1) 构建了三种重组大肠杆菌重组菌株，分别表达三种重组 PAI ：C 端融合 6×His-tag 的 PAI 、N 端融合 6×His-tag 的 PAI 和不带有 6×His-tag 的 PAI 。将经镍柱纯化后的 PAI 免疫兔子，得到 PAI 多克隆抗体。通过 SDS和 western blot 分析三种重组菌的蛋 白质表达情况，并利用气相色谱检测胞内相对酶活。结果显示，在相同的培养及诱导表 达条件下，三种重组大肠杆菌均成功表达了具有亚油酸异构酶活性的重组 PAI ，6×His-tag 的融合表达对于重组菌株的生长及PAI 的表达总量没有影响，但减少了PAI 可溶性表达 量，并且降低酶活，而 C 端添加亲和标签比 N 端对此影响更为显著。为了获得更多的 活性 PAI ，在产油真菌中异源表达PAI 基因时，应不添加任何亲和纯化标签。 (2) 对 M. alpina ATCC32222 的孢子产量、孢子萌发率、孢子收集方法和孢子对抗 生素敏感性进行了研究，确定最佳产孢培养条件是 28 ℃、 PDA 斜面上静置培养 30 天； 为了去除菌丝并减少孢子的损失，采用 60 目滤布和20 μm 滤膜结合的两步法过滤孢子 液；选择潮霉素作为筛选标记，潮霉素的最佳使用浓度为 0.8-1.5 mg/mL 。构建了两种带 有 PAI 基因的重组质粒：pD -pai 和 pBIG-pai ，分别用于基因枪轰击和农杆菌介导两种 4 转化法。对转化实验条件进行摸索，最终通过农杆菌介导转化法获得稳定的转化子。以 转化子的基因组 DNA 和 cDNA 为模板，通过 PCR 扩增证实了 PAI 基因成功整合在 M. alpina 转化子基因组上并发生转录，同时证明M. alpina 表达系统构建成功。但 M. alpina 重组菌未能成功表达亚油酸异构酶。来源于细菌的 PAI 基因和真核生物 M. alpina 在密 码子使用偏好性方面的差异可能是导致 PAI 异源表达失败的重要原因。 (3) 鉴于 PAI 基因在 M. alpina 中异源表达失败，首先根据 Y. lipolytica 的密码子偏 好性，优化了 PAI 基因，并在 PAI 基因的起始密码子前加上了 Kozak 序列。天然的 PAI 基因（pai ）和优化后的基因（opai ）分别以单拷贝整合方式整合到 Y. lipolytica 基因组 上。通过对重组蛋白表达量分析及产物 trans-10，cis- 12-CLA 含量测定，发现在七个整 合了pai 的重组 Y. lipolytica 菌株中，只在两个转化子中检测到了 PAI 蛋白，而十二个带 有 opai 的重组菌株中全部检测到了PAI 。脂肪酸分析的结果与蛋白表达结果一致，带有 天然 PAI 基因的转化子只有两个检测到产物 trans-10，cis- 12-CLA。经过密码子优化后， trans-10，cis- 12-CLA 平均产量提高了 10 倍，为 2.1 mg/L 。这些结果证明PAI 基因的优 II 化是在真核生物中成功实现异源表达的前提。通过多拷贝整合方式，进一步提高了 PAI 表达量和 trans-10，cis-12 CLA 含量，其平均含量为 14.3 mg/L，是 opai 的