产丁二酸谷氨酸棒状杆菌代谢工程育种.pdfVIP

摘 要 摘要 本文采用分子生物学手段选育谷氨酸棒状杆菌基因工程菌，得到一系列的基因工程 菌。并对谷氨酸棒状杆菌厌氧产酸条件进行了简单摸索和细胞重复利用进行连续产酸的 研究。主要内容及结果如下所示： (1)运用基因敲除技术敲除谷氨酸棒状杆菌 ATCC13032 乳酸脱氢酶基因，阻断乳酸 代谢支路，消除了主要副产物乳酸。得到乳酸脱氢酶缺陷菌株 CDW-S，其发酵液中乳 酸的产量由起始菌的 60.5g/L 降为发酵液中几乎检测不到乳酸，丁二酸及乙酸产量得以 显著增加。 (2)运用基因敲除技术对谷氨酸棒状杆菌中的丙酮酸脱氢酶系中 E1 酶进行基因敲除， 降低乙酸乙醇代谢支路，不仅大大降低了副产物乙酸的产量，而且丁二酸的产量也有小 幅提高。构建了双敲除工程菌 CDW-D, 乙酸的产量由 22.8g/L 降低到 13.6g/L，丁二酸 的产量从21.1g/L 提高到 45.5g/L 。 (3)为加强丁二酸的生物合成途径，引导碳源更多的流向 C4 合成代谢途径，本文对 草酰乙酸这一代谢节点进行调控，在 CDW-S 中表达了PEP 羧化酶及 PYC 羧化酶基因， 结果显示，羧化酶的过量表达都有助于丁二酸的累积，其中 PYC 羧化酶的过量表达对 丁二酸产量影响较大，但 PEP 羧化酶也能在一定程度上促进谷氨酸棒状杆菌厌氧合成丁 二酸。 (4) 由于 PEP 羧化酶和 PYC 羧化酶对谷氨酸棒状杆菌产丁二酸都有较为明显作用， 本论文构建了共表达的重组质粒 pDXW-8/pyc /ppc 。将该共表达的重组质粒在基因敲除 的重组菌 CDW-S 及 CDW-D 中过量表达。其丁二酸的产量有了显著的提高，基因工程 菌 CDW-S2 及 CDW-D2 ，其丁二酸产量分别为 62.9g/L、74.5g/L 。 (5)本文对所构建的基因工程菌株 CDW-D2 的产酸条件及菌体的重复利用进行了研 究。以 CDW-S2 为基础考察了温度、碳源及碳酸氢盐对谷氨酸棒状杆菌产丁二酸的影响。 发现谷氨酸棒状杆菌厌氧产酸对温度变化不是很明显，麦芽糖作为底物时丁二酸产量最 高为 85.8g/L，以葡萄糖作为底物时，碳酸氢钠添加量为 60g/L 时丁二酸产量最高为 74.8g/L 。以 CDW-D2 为基础考察了菌体重复利用进行产酸的研究，发现菌体连续重复 利用三代的情况下丁二酸的转化率及菌体的产酸强度保持不变。 关键词：基因敲除；谷氨酸棒状杆菌；共表达；丁二酸 I Abstract Abstract In this dissertation, genetic engineering bacterial derived from Corynebacterium glutamicum via genetic engineering breeding was carried out, and a series of genetic engineering bacterial were obtained. The conditions of C. glutamicum producing succnic acid under oxygen deprivation and reusing the cells to produce succnic acid consecutively were studied. The main contents and results are as follows: (1)The lactic dehydrogenase gene of C. glutamicum ATCC13032 wa