中心体复制功能的相关研究.PDFVIP

细胞生物学综述 中心体复制功能的相关研究 生物科学专业 张瑶 ARTICLE 1: 果蝇中中心粒复制相关蛋白的过度表达诱导中心粒过度复制和再次生成 研究结果： 1.DSas-6蛋白是果蝇中心粒复制必需的中心粒蛋白 利用抗体与蛋白结合，进行基因改造，在Ubq启动子的控制下，使表达的DSas-6与GFP （绿 色荧光蛋白）融合，DSas-6抗体微弱标记显示胚胎细胞周期各阶段的中心粒。发现GFP- DSas-6在果蝇胚胎细胞、幼虫大脑细胞和精母细胞的细胞周期中始终与中心粒联合。但不确 定GFP- DSas-6或内生的DSas-6是否也与PCM相联合；在western点记中，没有检测到内生 的DSas-6，GFP-DSas-6蛋白却很明显。DSas-6似乎通常是在较低水平表达的中心粒蛋白； 在DSas-6编码区插入piggyBac突变基因片段，75%的细胞有缺陷，25% 的细胞形态正常。 但不协调，而不协调的细胞课通过Ubq-GFP- DSas-6改造基因的表达得到改善；中心粒标记 物GTU88、GFP-PACT和GFP-F2r沿着中心粒长度分布，而GFP- DSas-6集中在精母细胞大中 心粒的最接近或远端部。对照的DSas-4-GFP和GFP-Sak也有相似的分布情况。（注:三种蛋 白都是利用Ubq启动子来实现蛋白过度表达的） 2. DSas-6蛋白的过度表达导致胚胎细胞中中心粒的过度复制 DSas-4-GFP集中在中心粒，跟踪中心粒的行为，发现胚胎细胞中心粒的行为正常；而GFP- DSas-6同样也集中在中心粒，用其跟踪中心粒，存在额外的正常功能的复制。使GFP-Sak5 与DSas-4-GFP或GFP-F2r共同表达，发现GFP-Sak过度表达诱导有丝分裂缺陷，但不能直接 看出中心粒的额外复制。 3.GFP-Sak和GFP- DSas-6的过度表达导致果蝇幼虫大脑中额外似中心粒结构物质大量堆积， 而精母细胞则不然。 检查幼虫细胞有丝分裂第三中间形态中心粒的数目，表现GFP- DSas-6过度表达时中心粒数 目有小的显著的增加。DSas-4-FP过度表达则无影响。GFP-Sak过度表达时则有较大显著性 增加；额外多数目的中心粒没有大的缺陷，其集众不是由于错误的胞浆移动；这些额外的结 构是由DSas-4和D-PLP核体标记，并围绕有PCM标记物；在DSas-4突变的情况下，Sak过度 表达无效应，DSas-4是中心粒的形成所必需。精母细胞中，三种蛋白的过度表达都无效应。 4.GFP-Sak、GFP- DSas-6或DSas-4-GFP高水平的过度表达引发中心粒再生成。 在通常无中心粒的未受精卵中检测蛋白过度表达效应，它们含D-PLP和DSas-4中心粒标记物， 组织PCM标记物Cnn和r-tubulin，由MT表达GFP-Sak或DSas-4-GFP的雌性产下的卵无中心 粒结构，而表达GFP- DSas-6的雌性产下的中卵则有。另外有大量的似中心粒结构分别在 UAS-GFP-DSas-6、UAS-Sak-GFP和UAS- DSas-4-GFP基因改造的雌性产下的卵中作用产生。 所有的似中心粒都是在卵被产下后的早期形成，随后数目即使增加也很小，检测由TLCM标 1 细胞生物学综述 记的未受精卵中每个GFP融合蛋白的行为，发现其在活细胞和固定细胞中具有同样的特征分 布，似中心粒机构的再生成不遵守中心粒母模板复制。（注：更高水平的蛋白表达是利用 UAS/Gal启动子实现的） 5.GFP- DSas-6、DSas-4-GFP或Sak-GFP 的过度表达不能阻止卵子形成时中心粒的丢失。卵 母细胞中的中心粒因聚集难以计数，而转而对保卫细胞中中心粒数进行计数。在 UAS-Sak-GFP表达的卵巢中，中心粒数目比野生型卵巢中保卫细胞各阶段显著多，表明中心 粒向卵母细胞转移受到阻止。虽然聚集的GFP不能标记中心粒标记物，在整个过程中都能观 察到，其他Ubq或UAS启动子引起的蛋白过度表达都没有这样明显的增加。在第14阶段，在 任何Ubq或UAS启动子基因改造表达后的情况中，都不能在卵巢中观察到D-PLP或 mRFP-PACT肯定的位点。 分析讨论： 1． 实验中，可直接形象化由中心