乙酰化修饰调控结核杆菌异柠檬酸裂合酶的研究.PDF

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１５，３５（６）：８１３ ＤＯＩ：１０．１３５２３／ｊ．ｃｂ 乙酰化修饰调控结核杆菌异柠檬酸裂合酶的研究 李瑶瑶　毕　静　王艺红　秦云贺　张雪莲 （复旦大学 生命科学学院遗传工程国家重点实验室　上海　２００４３３） 摘要　目的：探索结核杆菌异柠檬酸裂合酶（ＩＣＬ）蛋白３２２位点赖氨酸（Ｌｙｓ３２２）的乙酰化修饰对 蛋白功能的调控作用。方法：构建结核杆菌ＩＣＬ蛋白原核表达载体ｐＥＴ２８ａｉｃｌ，并对Ｌｙｓ３２２位点 ＷＴ ３２２Ｒ 进行定点突变为精氨酸（Ａｒｇ，Ｒ）和谷氨酰胺（Ｇｌｕ，Ｑ），体外表达纯化获得重组蛋白ＩＣＬ 、ＩＣＬ ３２２Ｑ 和ＩＣＬ 。通过Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ和酶活性测定来揭示Ｌｙｓ３２２位点突变前后对蛋白的乙酰化修饰 ＷＴ ３２２Ｒ 水平及蛋白功能的影响。结果：Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ检测发现大肠杆菌表达体系获得的ＩＣＬ 、ＩＣＬ ３２２Ｑ ＷＴ ３２２Ｒ ３２２Ｑ 和ＩＣＬ 蛋白均有较高水平的蛋白赖氨酸乙酰化修饰信号，较ＩＣＬ ，ＩＣＬ 和ＩＣＬ 突变蛋白的 酶活性分别下降了大约５０％和７０％。结论：在大肠杆菌的表达体系中，ＩＣＬ蛋白可以获得乙酰化 ３２２Ｑ 修饰。ＩＣＬ 突变蛋白酶活性的显著下降，揭示Ｌｙｓ３２２位点乙酰化修饰对ＩＣＬ蛋白的功能存在 负向调控。为未来深入探索赖氨酸乙酰化修饰对结核杆菌代谢，潜伏感染的调控作用奠定了基 础。 关键词　异柠檬酸裂合酶　乙酰化修饰　定点突变 中图分类号　Ｑ８１ 　　乙酰化修饰是细胞内蛋白翻译后修饰的一种重要 研究中发现ＩＣＬ蛋白３２２位点的赖氨酸存在乙酰化修 ［１］ ［５］ 形式，广泛参与细胞生长代谢等重要生理活动 。研 饰，近期报道也证实了该结果 。生理条件下，蛋白质 究表明赖氨酸（Ｌｙｓ，Ｋ）乙酰化修饰不仅存在于真核生 的赖氨酸残基侧链可以发生质子化，使得赖氨酸带上 ［２］ ［３］ 正电荷，而乙酰化修饰可以阻止赖氨酸残基发生质子 物，而且在大肠杆菌 ，沙门氏菌 等原核生物中也广 泛存在，是真核与原核生物共同保守的一种代谢调控 化，进而去除赖氨酸残基侧链上的正电荷，改变其生化 机制。近期发现蛋白乙酰化修饰在人类致病菌结核杆 特性或构象，因此受乙酰化修饰的赖氨酸残基表现为 ［１０］ 菌中也广泛存在，并且可能影响生物膜形成及碳源代 中性氨基酸的特性 。为探索赖氨酸乙酰化修饰对蛋 ［４５］ 白功能的调控作用，通常采用将赖氨酸位点分别突变 谢等重要生理功能 。 　　结核杆菌的代谢是其致病性的关键决定因素，特 成带正电荷的精氨酸（Ａｒｇ，Ｒ）来模拟该位点未被乙酰 别是当结核杆菌被巨噬细胞吞噬后，可以调节自身代 化修饰状态，以及不带电荷的谷氨酰胺（Ｇｌｕ，Ｑ）来模拟 谢来抵抗细胞内低氧、低ｐＨ等不利的微环境。此时结 位点受乙酰化修饰状态。当赖氨酸位点被突变成谷氨 核杆菌利用脂肪酸作为碳源，启动乙醛酸循环途径。 酰胺的蛋白功能发生更