生物专一吸附.PPTVIP

亲 和 层 析 Affinity Chromatography 一、概述 亲和层析：是利用生物大分子之间有专一的亲和力而达到分离纯化的层析方法 优点：1.纯化过程简单、迅速 2.分离效率高 3.实验条件温和 缺点：1.针对某一分离对象就需要制备专一的 吸附剂和建立相应的实验条件 2.配基的选择及其与基质的共价结合需 要烦琐的操作步骤 二、基本原理 生物专一吸附 (bioselective adsorption ) 1.具有专一性亲和力的生物分子对： 酶—底物（包括酶的竞争性抑制剂和辅 酶因子） 特异性抗原—抗体 激素—受体 DNA—互补的DNA或RNA 凝集素和糖蛋白 2.基本过程： ?固相化 ? (Immobilise) ? 配基Ligand:亲和层析中能被某一生物大分子识别和可逆结合的生物专一性物质。 基质Matrix(载体):亲和层析中与配基共价结合,使其固相化的物质。 ?吸附 ?(Adsorption) ? ?解吸 (Elution ) 三、载体的选择 应具备的特性： 1.有丰富的可供活化的化学基团，并在温 和条件下能与配基共价结合。 2.惰性的，非专一性吸附无或足够小。 3.多孔网状结构。 4.良好的机械性能，具有好的液体流动性。 5.有较好的物理和化学稳定性。 可供选择的载体 琼脂糖 商品名：Sepharose 型号：2B，4B，6B 型号含义：琼脂糖浓度为2%，4%，6% 特点：亲水性强，理化性质稳定，网孔大，非专一性吸附小，只能以湿态保存，经不起有机溶剂处理。 聚丙烯酰胺凝胶 商品名：Bio-Gel p 型号：P-100至-300 型号含义：排阻限度，X1000相当于允许进入凝胶内部蛋白质的最大分子量 特点：干胶，理化性质稳定,抗微生物侵袭能力较大,适用于配基和亲和物之间亲和力比较弱的系统,应避免在pH2-11以外的溶液中长期使用. 葡聚糖凝胶 商品名:Sephadex 型号:G-100,150,200 型号含义:每克干凝胶吸水量X10 特点:理化性质稳定,耐热耐碱不耐酸,网孔较琼脂糖小 四、配基的选择 应具备的特性： 1.对于欲纯化的生物物质应具有专一亲和性 2.必须具备能被修饰的功能基团 以酶和底物为例来讨论配基与欲纯化的生物物质的亲和性: KL E+L?EL 在亲和层析中,定义分配系数Kd为: Kd=结合酶/游离酶=[EL]/[E0-EL]=[L0]/KL 常数KL越小,配基对大分子的亲和力越高,在亲和层析中就越有价值。 配基可以是小分子物质：一些辅酶、辅基 大分子物质：酶、抗体 纯化酶的配基:底物、酶活性中心、抑制剂、辅酶、辅基等； 纯化抗原抗体的配基：互为配基 纯化核酸的配基：DNA和RNA，蛋白质和mRNA 五、配基的固相化 固相化技术：将配基以共价键连接于不溶于 水的固相基质上制成固相化吸附剂 过程：活化、接臂 插入剂或手臂使小分子配基适当的离开载体骨架,克服载体空间位阻的影响 六、亲和层析分离 （一）装柱和平衡 （二）上样、亲和吸附 （三）洗脱 1.洗脱后可能出现的洗脱图谱 酶与杂质一起流出 ? ? 酶与杂质没有完全分离 ? ? 酶与杂质完全分开 2.洗脱方法 ?非特异性洗脱:改变缓冲液的pH、离子强度、介电常数或温度使物质构象改变，浓缩、洗脱后立即中和稀释或透析，使蛋白质迅速恢复到天然结构 ?特异性洗脱：再次利用生物学特异性只洗脱和配基专一作用的酶，不洗脱由于非专一吸附上去的杂蛋白 （四）再生 亲和层析拄可在一次层析后用大量洗脱剂连续洗涤，然后再用平衡缓冲液平衡，经处理后的层析柱能再次使用。 七、亲和层析的应用 1.分离和纯化 2.分辨化学或遗传学上修饰的酶 3.纯化亲和标记的活性中心肽段和蛋白质 结构研究 4