第九课：微生物学设计性实验--细菌耐受噬菌体突变率测定.ppt

* 细菌耐受噬菌体突变率的测定 ——微生物创新性试验 第五组： * 细菌耐受噬菌体的突变是一种自发突变，它的发生与环境因子无关，是随机的非定向突变。 本组设计性实验题目： 测定铜绿假单胞菌耐受噬菌体的突变频率 * 实验选材依据和背景 铜绿假单胞菌（P.Aeruginosa） 原称绿脓杆菌。在自然界分布广泛，为土壤中存在的最常见的细菌之一。各种水、空气、正常人的皮肤、呼吸道和肠道等都有本菌存在。本菌存在的重要条件是潮湿的环境。 * 革兰染色 培养 绿脓杆菌 研究背景 本菌为条件致病菌，是医院内感染的主要病原菌之一。患代谢性疾病、血液病和恶性肿瘤的患者，及术后或某些治疗后的患者易感本菌。 筛选出优良菌种，以便更好地利用其资源进行研究并造福人类。同时又对其外界环境有更大的适应性，更好应用于发展、生产的需要。为获得其菌群，我们采用利用噬菌体将其敏感细菌杀死，从而选择耐受细菌。 * * 研究 概述 研究方案：为获得其菌群，我们采用噬菌体将敏感细菌杀死，将发生了耐受突变的细菌选择出来，并繁殖成为优势菌群。 研究意义：培养出优势菌群，为以后临床治疗及临床用药起辅助性作用。 研究目的：测定细菌自然情况下耐受噬菌体的自发突变频率。 研究问题：突变率测定 实验材料 1.毒性噬菌体及其相应的敏感宿主菌。 （建议使用人体正常菌群中的细菌及其噬菌体，如大肠埃希菌或铜绿假单胞菌及其相应噬菌体。） 2.LB液体培养基及LB固体培养基。 3.试管、培养皿、刻度定量吸管。 4.酒精灯、接种环、显微镜、普通培养箱等。 * LB是什么？ LB：Luria-Bertani培养基，即溶菌肉汤。 * 实验步骤 * 1.准备好铜绿假单胞菌的过夜培养物和相应的噬菌体原液（噬菌体效价10^10） 铜绿假单胞菌的倒置过夜培养物 噬菌体原液 实验步骤 2.将菌液10倍连续稀释，至少稀释7管，取0.1ml涂布接种LB琼脂平板，37度培养过夜。次日取菌落适宜于菌落计数的平板进行CFU计数，计算出每毫升菌液中的CHU数： CFU数=每个平皿中的CFU数×10×血清稀释倍数 * 2. * 10倍连续稀释，至少7管 CFU是什么？ CFU (Colony-Forming Units)：菌落形成单位,菌落形成单位。 将稀释后的一定量的菌液通过浇注或涂布的方法，让其内的微生物单细胞一一分散在琼脂平板上，待培养后，每一活细胞就形成一个菌落。与常规利用显微镜对微生物数量进行测量不同，主要是对可见（即多数情况下形成菌落）的细菌数量进行测量的单位。 单位：CFU/mL。指的是每毫升样品中含有的细菌群落总数，也有用CFU/g即对应固体培养基。 * 通俗的解释 是指每毫升菌液中含有多少单细胞 。传统上就叫“个”。但是，我们知道，一个菌落不一定是一个细菌所生成，也可能是由一簇细菌（一个细菌团）所生成，这时候再叫“个”就不太准确啦，准确的叫法就是“菌落形成单位”，英文缩写“CFU”。就像“公斤”和“千克”，只是叫法不同，数量上没有变化。 * 实验步骤 3.进入对数生长后期的大肠埃希菌或铜绿假单胞菌，菌数约为10^9CFU/ml左右。 2~3h后，可见菌液逐步变清，待完全变清（月4h之内），将全部菌液均匀涂布到一个LB琼脂平板上，置37℃下培养过夜。次日计数CFU。 * 4.耐受噬菌体突变频率的计算 第3步中获得的CFU数为1ml菌液中的耐受菌数量，第2步中获得的CFU数为1ml菌液中的总菌数。故： 耐受噬菌体突变频率 = * 第3步中获得的CFU数 第2步中获得的CFU数 实验可行性分析 1. 标本采集方便 本菌在自然界分布广泛，为土壤中存在的最常见的细菌之一。各种水、空气、正常人的皮肤、呼吸道和肠道等都有本菌存在。本菌存在的重要条件是潮湿的环境。　 采自不同感染部位的标本，包括血液、尿液、痰标本、脓汁、穿刺液等。还包括来自医院环境中的各种标本如水、空气、物体表面采样等。 * 2.分离培养容易 本菌生长对营养要求不高。 3. 生长特点明显 该菌在4℃不生长而在42℃ 可以生长。（可用以鉴别） 4.采用CFU计数的科学性。 5.实验现象明显，便于观察。 * 预期结果 * 稀释度 10-1 10-2 … 10-7 1 2 3 平均 1 2 3 平均 … 1 2 3 平均 CFU数/平板 ? ? ? ? ? ? ? ? … ? ? ? ? 每毫升的CFU数 ? ? … ? 预期结果 经相关文献预测： 铜绿假单胞菌耐噬菌体的突变机率在1.4×10^-7～7.9×10^-7之间。 * 讨论 上述操作3，