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关于细胞凋亡的讨论 细胞调亡与坏死鉴别的简便方法 midas1、PI和Hoechst33342双标： ?? ?PI、Hoechst33342均可与细胞核DNA（或RNA）结合。但是PI不能通过正常的细胞膜，Hoechst则为膜通透性的荧光染料，故细胞在处于坏死或晚期调亡时细胞膜被破坏，这时可为PI着红色。正常细胞和中早期调亡细胞均可被Hoechst着色，但是正常细胞核的Hoechst着色的形态呈圆形，淡兰色，内有较深的兰色颗粒；而调亡细胞的核由于浓集而呈亮兰色，或核呈分叶，碎片状，边集。 故PI着色为坏死细胞；亮兰色，或核呈分叶状，边集的Hoechst着色的为调亡细胞。我最近在作的试验就是用的这种方法，附上一张我染的PC12细胞的图片，请大家指教。更精确的定量可以通过流式细胞仪来检测。用PI和Hoechst33342双标鉴别调亡、坏死，这种方法简便易行，结果比较可靠。 （图片见/bbs/post/view?bid=66id=55585tpg=1ppg=1sty=1age=0#55585）2、PI和Calcein-Am双标： ??? Calcein-AM 是一种绿色荧光标记物，可显示胞浆，为膜通透性的荧光染料。Calcein-AM 一旦进入胞内，便可被内源性酯酶水解成绿色荧光物质calcein, 并保留在胞浆中。细胞处于调亡时，由于核成碎片状，从而使此时的胞浆的calcein着色呈碎片状，但是PI为阴性。细胞坏死时，胞浆的calcein染色基本上属于正常，但是PI为阳性，有时可以看到膜内有空泡。但是晚期调亡细胞，胞浆有calcein着色并呈碎片状，而且PI为阳性。 3、PI和Annexin-V双标： ??? Annexin-V（green）可以和胞膜内的磷脂酰丝氨酸（PS）特异性结合。正常细胞膜的磷脂双分子层排列整齐，但是如果细胞损伤时，酯脂双分子层的排列就会被打乱，内层的可能会翻转到外层，Annexin-V就可以检测到这种现象。因此细胞处于调亡或坏死时，Annexin-V可为阳性（早期的坏死细胞可能为阴性）。但是只有坏死的细胞PI是阳性。  可用confocal来进行双标观察计数或流式细胞仪定量检测。 4、Leukostat染色： ??? 活细胞Leukostat染色，核呈棕色，胞浆透明；调亡细胞核浓集，呈黑、褐色，变小，胞浆不可见；坏死细胞溶解呈空壳。 这种方法现在少用。  补充：鉴别细胞调亡与坏死的方法挺多，但大多比较繁琐，我总结的这几种方法则是简便易行，最适合于经费比较紧张的研究生们。 针对朋友的提问，回答如下： 1、试剂来源： PI和Hoechst33342都是sigma公司的粉剂，不是kit， 2、具体方法： 将PI和Hoechst33342的终浓度调到10μg/mg就行，用PBS，Hanks液、生理盐水或D液任何一种溶解都可以。Hoechst33342染色37℃10min就达到饱和，PI在4℃10~20min就行。 3、文献出处：  A，《细胞实验指南》上册，p102－125，现代生物技术译从－－科学出版社，  B， 有好几篇文献，只列出其中的一个：  Ha HC, Snyder SH.  Poly(ADP-ribose) polymerase is a mediator of necrotic cell death by ATP depletion.  Proc Natl Acad Sci U S A. 1999 Nov 23;96(24):13978-82.  全文链接：/cgi/content/full/96/24/13978  4、鉴别晚期凋亡和坏死的方法我还没有找到，但是这两者要区别是比较困难的， sorry！ fang3326：有什么实验技术可以区分凋亡和坏死啊？ hxc：碘化丙啶（propidium iodide,PI）检测。早期死亡细胞膜通透性状态的不同是区分细胞凋亡和坏死的一个重要指标，凋亡细胞在进入最终溶解阶段前，胞膜通透性无明显改变，相对分子质量大的与DNA结合的荧光染料（如PI）不能时入凋亡细胞内，而相对分子质量小的荧光染料（如Hoechest 3342或33258等）仍能被细胞摄取。应用流式细胞仪或荧光显微镜可区分和坏死细胞，细胞内DNA出现Hoechest 3342标记而不出现PI标记的为凋亡细胞。 检测方法：获取11×106细胞/ml的细胞悬液，先用PI染色，再行Hoechest3342染色，进行流式细胞仪分析或荧光显微镜观察。PI及Hoechest3342均使用340nm紫外线激发，前者荧光为红色（620nm）,后者荧光为蓝色（480nm）。正常细胞蓝色最强。早期凋亡细胞由于D