模板DNA与引物的退火.PPTVIP

第七节 基因扩增 一 PCR技术的基本原理及特点 （一）PCR技术简史 （二）PCR的基本原理 （三）PCR反应体系 （四）寡核苷酸引物 （五）PCR反应的特点 （六）PCR引物的设计一般原则 （七）PCR中应注意的事项 Denaturation Template DNA by Heat (95oC) PCR Cycle - Step 2 – Temperature is lowered (Tm ) and primers anneal to target sequences PCR Cycle - Step 3 - At 72 o C Taq DNA polymerase catalyses primer extension as complementary nucleotides are incorporated End of the 1st PCR Cycle – Results in two copies of target sequence Target Amplification 1）PCR反应的具体步骤： 1.变性 94℃ 30-90s 预变时间稍长，使模板充分变质 提高温度会缩短所需时间，但过高温度或过长时间会破坏酶和dNTP 2.复性 40-65℃ 30-90s 变性结束后，令DNA快速冷却，以原模板和引物转录复制。再进行退火步骤。复性所需温度决定引物在模板上退火的几率和特异性。 3.延伸 70-75℃ 30s-8min 酶的最适反应温度在70-75 ℃之间，延伸温度一般选在72 ℃，延伸时间长短由扩增产物的长度决定。 4.循环次数 25-35之间 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 （六）PCR引物的设计一般原则 1.引物长度一般以18～30bp为宜，过短则降低特异性，过长则会引起引物间的退火而影响有效扩增，同时也增加引物合成的成本。 2.避免引物内部出现二级结构，避免序列内有较长的回文结构，使引物自身不能形成发夹结构。 3.G/C和A/T碱基均匀分布， G+C含量在40～60%之间，引物碱基序列尽可能选择碱基随机分布，避免出现嘌呤或嘧啶连续排列。 4.要避免两个引物间特别是3`末端碱基序列互补以及同一引物自身3`末端碱基序列互补的，使它们不能形成引物二聚体或发卡结构。 5.引物3`末端碱基一般应与模板DNA严格配对，并且3`末端为G、C或T时引发效率较高。 6.引物5`末端碱基可不与模板DNA匹配，可添加与模板无关的序列(如限制性核酸内切酶的识别序列、ATG起始密码子或启动子序列等)，便于克隆和表达，但其保护碱基有一定的要求。 7.引物的碱基顺序不能与非扩增区有同源性。 （七）PCR中应注意的事项 1.防止污染 试剂小量分装 吸头及EP管一次性使用 器皿及工作区域要分开，无菌操作 2.设立对照： 阳性对照： 阳性模板 阴性对照： 阴性模板 试剂对照： 除模板外的所有组分 二 PCR技术的研究应用 1.基因组克隆 2.反向PCR 　 7.锚定PCR 3.不对称PCR 8.原位PCR 4.RT-PCR 　　　　　　9.重组PCR 5.差异显示PCR　　　　10.免疫PCR 6.实时定量PCR　　　　11.多重PCR 3.RT－PCR:是以反转录的cDNA作模板所进行的PCR反应,用于测定基因表达的强度和鉴定已转录序列是否发生突变,呈现mRNA多态性,克隆mRNA的5’和3’末端序列,以及从非常少量的mRNA样品构建大容量的cDNA文库。 检测RNA分子； 获取测序模板DNA； 克隆mRNA之cDNA拷贝。 5.实时定量PCR技术 (real-time PCR): 实时定量PCR（也称TaqMan PCR,以下简称FQ-PCR）是美国PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出来的一种新的核酸定量技术，该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针来实现其定量功能的，与变通PCR相比，FQ-PCR具有许多优点。 通过特定设计的PCR仪器来实时检测PCR扩增过程每一轮循环产物的累积数量，可以很好的推算模板的起始浓度，这种工作方式称为实时定量PCR。 （1）原理和方法:FQ-PCR的工作原理是利用Taq酶的5’→3’外切酶活性，在PCR反应系统中加入一个荧光标记探针。该探针可与引物包含序列内的DNA模板发生特异性杂交，探针的5’端标以荧光发射基因FAM（荧光发射峰值在518nm处），靠近3’端标以荧光淬灭基团TAMRA（荧光发射峰值在582nm处），探针的3’端被磷酸