D-多巴手性转化和其机制的研究.pdfVIP

D-多巴手性转化及其机制的研究 硕士学位论文 第三章 D-dopa 在肾匀浆中发生了单向的手性转化 1961 年 Birkmayer 等发现左旋dopa 具有抗帕金森病作用 这是帕金森药物治 疗史上的革命性创举 从 1973 年上市至今 左旋 dopa 的临床使用史已达32 年 虽然大多数长期使用左旋 dopa 的患者会出现一些副反应 比如异动症和运动反应 性波动 但是其一线治疗药物的地位依然不变 毕竟 左旋 dopa 维持着连续 5 年 以上的症状改善率达 70-90% 的金标准 随着神经药理学的深入开展 学者们发现 D-dopa 和 L-dopa 一样 能令纹状体单侧损伤的大/小鼠产生旋转效应[30, 31, 32, 33] 虽 然各位作者在 D-dopa 的效力上未达成一致意见 不过 他们均认同 在整体动物 中 D-dopa 具有类似与L-dopa 的药理学效应 且 D-dopa 的效应相对于L-dopa 来 说存在时滞 此外 在体外培养的大鼠胚胎中脑多巴胺神经元细胞中 加入L-dopa (10 + nM)可以引发酪氨酸羟化酶阳性(TH )神经元的显著性死亡 D-dopa 也可以产生同 + 程度的致TH 神经元死亡效应 不过所需剂量为 100 ìM 两者之间剂量比约为 10 000[34] 学者们因此猜测 D-dopa 极有可能发生了向L 型异构体的手性转化 D-dopa 的效应主要来自于转化生成的 L-dopa[30, 31, 32, 33] 然而 至今没有确凿的证据来证实 该猜测 鉴于 dopa 在帕金森综合症治疗中的重要地位 如果这一猜想属实 对于药理 学和临床治疗学都将产生具有显著的意义 甚至于可以打破人们在用药观念上排除 D 型氨基酸的惯性思维 故我们利用自己建立的手性配体交换-高效液相方法(参见 2.3) 观察D-dopa 在肾匀浆中的孵育物中是否转化生成了L-dopa 需要指出的是 本文所有的dopa 转化实验均在肾匀浆中进行 这是因为 一 dopa 给予整体动物后 受儿茶酚胺-O- 甲基转移酶(COMT)和外周芳香族氨 基酸脱羧酶(DDC)代谢旺盛 血药浓度在 10-20 ìM 之间[53] 小量血浆样品中 dopa 的残留量很少 正是因为这个客观原因 目前的研究通常都是借助于电化学检测器 2+ 但是 电化学检测器价格昂贵 其工作原理是否与含 Cu 的手性配体流动相相容 26 D-多巴手性转化及其机制的研究 硕士学位论文 尚未见报道 故而 我们没有采用在动物整体实验中观察 D-dopa 转化的实验计划 改用动物组织匀浆进行体外孵育实验 二 目前已有报道证明 肾脏是D-氨基酸转化的主要器官[20 , 25 , 36] 所以我们选 择肾脏的组织匀浆作为孵育体系 3.1 仪器与设备 仪器 日本岛津LC-2010C高效液相仪 Kromasil C18柱(250 4.6mm 5 ìm 上 海通微分析技术有限公司) 3.2 匀浆孵育设计 第一组 取70 ìl D-dopa 5mM, 溶于0.01M盐酸 和100 ìl肾匀浆 肾匀浆制备 方法参见2.3.4 至1.5ml离心管 并用50mM Tris-HCl缓冲液补足体积至200 ìl 涡 旋振荡混匀 30 静置孵育2h n 5 第二组 取同体积的L-do