载脂蛋白M在血糖调控中的应答反应机制及作用（Response mechanism and function of apolipoprotein M in blood glucose regulation）.pdfVIP

载脂蛋白M 在血糖调控中的应答反应机制及作用 中文摘要 第一部分 实时荧光定量PCR 检测人载脂蛋白M 基因表达的方法 【摘要】目的：建立检测人载脂蛋白 M （Apolipoprotein M, ApoM ）的实时荧光定量 PCR 技术。方法：采用 Primer Express Versions 2.0 设计引物及 TaqMan 探针，检测 ApoM 基因的表达。将扩增的 ApoM 基因片段纯化后与 pMD19-T 载体连接，克隆构 建含 ApoM 基因片段的重组质粒，作为定量检测 ApoM 基因表达的标准品。结果： PCR 扩增产物经测序分析证实为 ApoM 特异性片段。本法灵敏度为 40copies/μl，线 性范围为 4.00×101～4.00×108 copies/μl，相关系数为 1.000，扩增效率E 为 90.5%，批 间变异系数为 6.38%～17.9%。结论：成功建立了检测人 ApoM 基因表达的实时荧光 定量 PCR 方法，且该方法特异性好，灵敏度高。 关键词：载脂蛋白 M ；实时PCR ；TaqMan 探针 第二部分 游离脂肪酸下调载脂蛋白M 表达 【摘要】目的：由于胰岛素抵抗的病人表现为糖代谢异常，并且血浆游离脂肪酸 （Free fatty acid, FFA ）水平明显升高，因此，本部分的研究目的是明确FFA 水平升高是否 影响 ApoM 的表达。方法：用不同浓度棕榈酸处理人肝癌细胞株（HepG2 细胞 ）以 及经颈静脉或尾静脉给大鼠输注脂肪乳，采用 Real-time PCR 及 PCR 芯片分析 FFA 对 ApoM 表达的影响和可能的机制。结果：大鼠输注 20%脂肪乳 6h 后，血浆 FFA 水 平升高到对照组的 17.6 倍（P0.01 ），葡萄糖输注率（Glucose infusion rate，GIR ）下 降了27% （P0.001 ），大鼠肝脏ApoM mRNA 水平明显下调（P0.05 ）。单因素方差 分析表明，0、0.25、0.5 及 1mM 棕榈酸分别作用 HepG2 细胞后，组间 ApoM mRNA 表达水平有显著差异（P0.01 ），1mM 组与 0mM 相比，ApoM mRNA 表达水平显著 下降（P0.01 ）。PCR 芯片检测结果显示， 1mM 棕榈酸组三磷酸肌醇激酶 （Phosphatidylinositol 3-kinase ，PI-3K ）途径的主要组分及靶基因、丝裂原活化蛋白 I 激酶（Mitogen-activated protein kinase, MAPK ）途径的主要组分及靶基因、过氧化物 酶体增殖物激活受体 γ （Peroxisome proliferator-activated receptor gamma, Pparg ）及其 靶基因、固醇调节元件结合蛋白 1 靶基因以及与细胞周期、增殖相关基因的表达明显 高于对照组；大鼠肝脏 PCR 芯片的检测结果也表明，输注脂肪乳后，以上几个信号 途径的基因或靶基因的表达水平也显著升高。结论：FFA 可能通过PI-3K 和/或PPARβ/δ 信号途径调节 ApoM 的表达，详细机制还需进一步研究。 关键词：载脂蛋白 M ；游离脂肪酸；实时PCR ；PCR 芯片；PI-3K 第三部分 高浓度葡萄糖不通过游离脂肪酸途径下调载脂蛋白M 【摘要】目的：明确短时输注高浓度葡萄糖是否通过游离脂肪酸途径下调载脂蛋白M 。 方法：经颈静脉或尾静脉给大鼠输注葡萄糖和/或罗格列酮（胰岛素增敏剂）；改良比 色法检测 FFA 水平；HEC 试验测定 GIR ；Real-time PCR 检测 ApoM mRNA 水平。结 果：大鼠尾静脉输注 25%葡萄糖后，血浆 FFA 浓度显著低于输注 5%葡萄糖组 （P0.001 ）。罗格列酮对健康大鼠血浆FFA 浓度的影响无统计学差异（P0.05 ）。 双因素方差分析（Two-Way ANOVA ）表明罗格列酮和高浓度葡萄糖对大鼠血浆 FFA 影响的交互作用无统计学意义（P0.05 ）。葡萄糖和罗格列酮对GIR