1级生物技术1班发酵工程实验计划方案.doc

生物技术一班发酵工程实验计划方案 一、实验日程表 序号 实验项目 时间 实验内容安排 1 培养基制备与灭菌 预计8学时 固体培养基配制500mL/组，分装2瓶； 培养皿清洗及包扎10副/组；无菌水90mL/瓶，9 mL/试管共6支； 1 mL or2 mL吸管包扎8支/组； 液体培养基制备：500ml/组，分装8瓶，灭菌0.1MPa,20min. 2 菌种分离 预计4学时 1、菌种的分离纯化:超净工作台消毒（UV照射20min）→75%乙醇擦拭台面；分离样品→无菌水溶解(稀释10-2倍)→涡旋震荡5min；倒平板(10副平皿/组)→平板划线分离→30℃倒置培养→目标菌株获得→制片及观察（显微摄影）。 3 种子制备 预计4学时 1、接种准备工作：超净工作台消毒（UV照射20min）→75%乙醇擦拭台面。 2、纯种培养接种：平板单一菌落→种子培养基（2环/瓶）→涡旋震荡3-5min； 3、摇瓶培养：摇床设置及调节（30℃，200r/m）→摇瓶固定→启动培养。 4 发酵罐结构认识、操作规程及分批发酵操作 预计8学时 发酵培养基配制：20Lor35L。 发酵罐操作培训：发酵罐初始状态检查及调节→清洗（清水冲洗2-3遍）→发酵罐运行启动→发酵罐运行参数设置→空罐灭菌（0.15MPa,20min）→进料→实罐灭菌（0.1MPa维持30min）→冷却→火焰封口接种→发酵参数稳定状态调节与维持。 发酵取样：取样管灭菌→取样→再灭菌； 发酵中间过程分析（0 hour）： pH测定（pH计or精密试纸）；酸度（中和法）；酶浓度测定（福林酚法）；菌体浓度测定（A600光密度法） 中间取样：每间隔4h, 取样管灭菌→取样→再灭菌.共计4-6次 ； 发酵结束工作：器皿、设备还原，环境清洁 实验分组 第一组：薛盛、张川、周宁、殷清玉宇、周辰栋、杨朝伟、吴迪、 刘洋、刘丽婷 （负责人：吴迪） 第二组：张怡、沈飞、徐依依、陆佳桦、吴冰燕、王芸清鉴、叶晨、 汪素红、刘杏、刘文跃 （负责人：沈飞） 第三组：田玉寒、闻宁、林飞敏、李林棋、丁铭、周欣欣、罗斯、 蒋秋艳、刘宇霞 （负责人：田玉寒） 时间分配 前三周的周二晚发酵理论课照上，因此各组的固定实验时间如下： 第一组固定实验时间：周一下午、周三晚上 第二组固定实验时间：周二中午、周四上午 第三组固定实验时间：周五下午、周五晚上 后三周的周二晚无理论课，各组集中在周二晚实验 前三周每周安排两次实验，以获取更多的实验数据，后三周每周一次集体实验 几个重要时间节点为：第10周正式进入实验程序； 第13周获得目标菌株1株； 第14周完成种子的摇瓶培养； 第15周分别完成上罐发酵； 第16周实验收尾工作。 四、实验内容 实验一 产蛋白酶微生物菌株的分离 【实验材料】 1、采样样品 食堂泔脚等残存蛋白质丰富的环境周围的土壤或其它蛋白质腐败材料。 2、培养基 （1）增殖培养基：蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，氯化钠5 g/L，pH 7.0～7.2，0.1MPa，灭菌20min。 （2）分离纯化培养基：酪蛋白10 g/L，Na2HPO4 6 g/L，KH2PO4 3 g/L，NaCl 0.5 g/L，NH4Cl 1 g/L，FeSO4 0.025 g/L，酵母膏0.2 g/L，MgSO4 0.24 g/L，CaCl2 0.011 g/L，溴百里香酚兰0.05 g/L，琼脂20 g/L，pH 7.0～7.2，0.1MPa，灭菌20min。 （3）菌种保存培养基：蛋白胨10g/L，牛肉膏3 g/L， NaCl 5g/L，琼脂 20g/L，pH 7.0～7.2，0.1MPa, 灭菌20min。 （4）无菌水：90 mL无菌水/250 mL三角瓶; 9 mL无菌水/试管6支。 3、实验器材 刮铲、一次性手套、无菌小塑料袋、试管、三角瓶、培养皿、吸管、接种环和涂布棒等。 4、实验设备 涡旋振荡器、超净工作台、高压灭菌锅、振荡培养箱、恒温培养箱、（数码）显微镜。 【实验步骤】 1、采样 分别取食堂泔脚池周边土壤，腐烂基质或其它可能含有蛋白酶生产菌的生物制剂10g装入无菌小塑料袋，在超净工作台上将样品混合均匀从中称取1g作为待增殖的采样样品。 2、增殖培养 1g待增殖的采样样品加入50 mL增殖培养基/250 mL三角瓶中，涡旋振荡器上振荡5min，可设置3组平行。混匀的液体置于30℃，180 r/min振荡培养箱中摇瓶培养36 h。增殖后的培养液置于80℃水浴中加热10 min去除营养体细胞，迅速取出冷却至常温，待用。平行样可以在加热处理后再合