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TSA 处理转基因体细胞对克隆胚胎发育的影响标题1 吴侠，于海泉，杨东山，岳永莉，王玲玲，李轲涵，李燕，辛鹏慧，旭日干 内蒙古大学哺乳动物生殖生物学生物技术教育部重点实验室，呼和浩特（010021 ） E-mail：haiquan_yu@ 摘 要：体细胞在去核卵母细胞中的不完全重编程被认为是导致克隆胚胎发育失败的主要原 因。本研究探讨了使用组蛋白去乙酰化酶抑制剂（Trichostatin A ， TSA ）处理转基因供体 细胞对基因组甲基化、报告基因表达及克隆胚胎发育的影响。结果表明，转基因供体细胞对 TSA 存在明显的剂量效应。当 TSA 达 100ng/mL 时，产生明显的细胞毒性，大量细胞死亡 （P0.01 ）。当TSA 在较低浓度（5-50ng/mL ），细胞形态发生改变，细胞增殖明显抑制，S 期细胞明显减少，细胞抑制于G0/G1 期。使用10 到50ng/mLTSA 处理供体细胞，明显增加 了报告基因的表达，并且基因组DNA 甲基化水平明显将低。使用经TSA 处理的体细胞作 为供体进行核移植发现，融合率明显增加；比较处理组与对照组重构胚胎，8 细胞发育率明 显增加(52.4%, 44.8% and 51.9% vs. 36.1%)。但是，TSA 处理的供体细胞并没有增加克隆胚 胎的桑椹胚和囊胚的发育(28.8% vs 34.1%、32.3%、14.8%；21.1% vs 22% 、16.7 ％、9.9%)。 结论：TSA 处理供体细胞明显降低了基因组DNA 甲基化水平，激活报告基因表达。报告基 因表达的改变可以作为判定基因组DNA 甲基化水平转变的标志。但是，低DNA 甲基化的 供体细胞没有促进克隆胚胎的发育。 关键词：TSA ，重编程，牛体细胞核移植 中图分类号：Q954.4 1. 引言 自从1997 年Willmut 等人使用分化了的体细胞获得第一只体细胞克隆动物以来，这项 技术已经在其他动物上获得成功[1]。但是，体细胞重构胚胎发育率低，胎盘发育异常，高 的流产率及出生后的异常是制约这项技术广泛应用的主要原因。目前研究认为造成这些发育 异常的原因主要在于体细胞基因组在卵母细胞质中经历去分化，恢复全能性及启动胚胎发育 的重编程过程不完全[2-4]，目前有关重编程的机理还不清楚，基因组DNA 甲基化、组蛋白 乙酰化被认为是重编程的重要因素。在正常的受精、发育过程中，基因组DNA 不对称的去 甲基化、重新甲基化及组蛋白乙酰化修饰转变发生在整个受精和胚胎发育过程中[2, 5]。然 而，克隆胚胎的发育过程中，存在类似供体细胞的高的甲基化水平以及异常的去甲基化[6, 7] 。因此，克隆胚胎基因组异常的甲基化修饰转变可能是导致胚胎发育异常的主要原因。 Trichostatin A (TSA)是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂。以前的研究显示，TSA 可以特异 的抑制组蛋白去乙酰化酶活性，降低DNA 甲基化水平，激活管家基因、印记基因的表达[8]。 然而，将TSA 用于核供体细胞的处理，探讨药物处理体细胞对克隆胚胎重编程影响的研究 较少。2003 年Enright 等，利用TSA 处理体细胞导致体细胞组蛋白乙酰化明显增加，且增 加了克隆胚胎的发育。但是，基因组DNA 甲基化转变没有发生[9]。因此，低的供体细胞基 因组甲基化水平是否促进克隆胚胎发育还有待研究。本研究以eGFP 转基因体细胞为供体细 胞，探讨了TSA 对转基因细胞形态、细胞周期、报告基因表达及克隆胚胎发育中的作用。 1 本课题得到教育部博士点基金项目“体外受精技术和克隆技术影响绒山羊早期胚胎发育和基因表达的机 理”（20050126005 ），内蒙古自然科学基金重点项目“牛体细胞克隆胚重编程中核质关系与表观遗传修饰 的研究”（200508010403 ）资助。 - 1 - 2. 材料、方法 2.1 供体细胞分离培养 海福特耳尖皮肤局部先用手术刀片刮毛，再用 70%-75%酒精消毒，用组织剪迅速剪取 耳尖约1m3 大小，立即