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实验五实验五 DNADNA的酶切与连接的酶切与连接 EE-mail:mail: huanglh@scnuhuanglh@cn 本节课讲义请到如下网址下载： http://www/blog/insecthuangcn/blog/insecthuang.htmhtm 实实 验验 目目 的的 基本原理： 1、掌握限制性内切酶的特性和酶切的目的和原理 2、掌握DNA连接酶的一般性质和作用机制 基本操作基本操作：： 1、掌握限制性内切酶酶解体系的建立及酶切样品的检测 2、掌握DNA连接体系的建立以及连接样品的检测 通过DNA重组技术构建DNA重组子 利用限制性核酸内切酶切割DNA和利用DNA连接酶 连接连接DNADNA是是DNADNA重组过程中的关键步骤之重组过程中的关键步骤之一。成功的成功的 酶切和有效的连接为后续的外源基因进入宿主细胞进行 表达提供了有效的实验材料表达提供了有效的实验材料。 酶切 连接连接 实实 验验 原原 理理–– 酶切酶切 限制性内切酶能特异性地结合于一段被称为限制性 酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异性位点上， 并切割双链DNA。 根据限制酶的识别切割特性根据限制酶的识别切割特性、催化条件及是否有修催化条件及是否有修 饰酶活性，可分为Ⅰ型、 Ⅱ型和Ⅲ型三类。DNA重组技 术中最常用的是术中最常用的是ⅡⅡ型酶型酶，切割后得到的是带粘性末端或切割后得到的是带粘性末端或 平末端的线性DNA。 II型限制性内切酶： 如: EcoRI的识别顺序为： 由两种酶分子组成的复合体，一种具有 限制性内切酶功能，另一种为独立的甲 5’…… G A A T T C ……3’ 基化酶功能基化酶功能，，它们具有识别同它们具有识别同一序列的序列的 33’…….CC TT TT AA AA GG …… 55’ 能力，但却发挥不同的作用。 回文结构的对称轴 主要特点： 识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个 或6个核苷酸，少数也有识别5个核苷酸 以及以及77个个、88个个、99个个、1010个和个和1111个核苷个核苷 酸的。在分子克隆实验中使用最普遍的 是那些识别4个或6个碱基对的限制性内 切酶。II 型限制性内切酶的识别顺序是 一个回文对称顺序，即有一个中心对称 轴轴，，从这个轴朝两个方向从这个轴朝两个方向 “读读”都完全都完全 相同。这种酶的切割可以有两种方式： 粘性末端和平头末端。 限制性内切酶的活性以酶的活性单位表示，1个酶单位 （1 Unit）指的是在指定缓冲液中，37℃下反应60min,完 全酶切1μg的纯DNA所用的酶量。 影响酶切的因素影响酶切的因素：：在酶切反应中在酶切反应中，，DNADNA的纯度的纯度、、缓冲液缓冲液 中的离子强度、Mg2+等因素均可影响反应，一般可通过增 加酶的用量加酶的用量，延长反应时间等措施以达到延长反应时间等措施以达到完全酶切完全酶切。但应但应 该注意的是，过多的酶量和过长的反应时间会造成非特异 性的酶切性的酶切 ((星号活性星号活性))。图图::构建构建DNADNA重组子重组子 实验原理– 连接 核酸片段可以通过连接酶的作用核酸片段可以通过连接酶的作用 连接起来而获得重组分子。 DNADNA连接酶催化双链连接酶催化双链DNADNA分子中分子中 相邻碱基的5’- P末端与3’-OH 间形成3’,5’-磷酸二酯键。 一个DNA片段的5’-P末端与另一 个个3’-OH末端相末端相互靠靠近时时，在在 DNA连接酶的作用下，有Mg2+, ATP存在的缓冲系统中可以被 连接起来而形成重组分子。