红色荧光蛋白在酿酒酵母中的表达特性研究.pdfVIP

中国医药生物技术 2012 年 4 月第 7 卷第 2 期 Chin Med Biotechnol, April 2012, Vol. 7, No. 2 93 DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2012.02.002 ·论著· 红色荧光蛋白在酿酒酵母中的 表达特性研究 史彦薇，王志芳，王伟，安建梅，孔建强 【摘要】 红色荧光蛋白(red fluorescent protein ，RFP)是 目的 研究红色荧光蛋白编码基因 Dsred 在酿酒酵母菌中 从珊瑚纲生物中分离出来的一类与绿色荧光蛋白 的快速克隆与表达。 （green fluorescent protein，GFP ）同源的荧光蛋白， 方法 根据已发表基因序列设计引物，采用连续重叠 PCR 其在紫外光的照射下可发射红色荧光[1] 。自 1999 方法快速克隆获得全长 Dsred 基因，将其与 pMD-18T 载 年首次被分离出来至今，红色荧光蛋白以其激发和 体连接后进行测序鉴定。通过 In-fusion 方法将鉴定正确的 发射波长较长、细胞内成像背景低、细胞毒性小而 pMD-Dsred 重组载体与酿酒酵母表达载体 pYeDP60 进行 备受关注并广泛应用。迄今为止，红色荧光蛋白已 连接，测序后利用 LiAc 方法将鉴定正确的 pYeDP60-Dsred 经拥有多种突变体[2-10] ，与最初的红色荧光蛋白相 重组表达载体转化至酿酒酵母菌 W303-1B 中，PCR 扩增 比，突变体红色荧光蛋白在成熟时间、荧光强度、 筛选阳性克隆，获得的 W303B[pYeDP60-Dsred] 工程菌经 发射波长以及聚集程度方面均有很大改观，同时更 诱导培养后进行 SDS电泳分析和绿光激发荧光成 多成熟时间短[2-4] 、荧光强度强[5-7] 、发射波长更长 像检测。将工程菌分别接种至 YPD 、YPG 、SCG 和 SCD 培 的单体红色荧光蛋白[8-10]也得以成功开发应用。不 养基，培养 48 、72、96、120 和 144 h 后分别测定吸光度 仅如此，红色荧光蛋白性能的改善还使其更多地被 用于分子标签[11-13] [14-16] （A600 ）值。取诱导表达后的工程菌（菌液组）进行离心（菌 以及蛋白相互作用 的研究。 体组）、离心后加甘油（高渗组）处理，分别置于 –70 、–20 、 为了更好地拓宽红色荧光蛋白的应用领域，本实验 4 、28 和 37 ℃ 条件培养，荧光显微镜观察其表达特性。 尝试将红色荧光蛋白 Dsred 基因导入酿酒酵母菌， 结果 连续重叠 PCR 扩增和测序鉴定结果表明，扩增获得 实现红色荧光蛋白在酿酒酵母菌体内的异源表达； 同时为缩短红色荧光蛋白的成熟时间，对缺水环 的 Dsred 基因长为 678 bp ，其序列与已发表的基因序列完 境中红色荧光蛋白的表达特性进行了分析，以期 全一致；Dsred 基因已成功插入 pYeDP60-Dsred 重组表达 载体，且受酵母诱导型启动子 GAL10-CYC1 调控表达。PCR 为红色荧光蛋白更好地应用于双分子荧光互补 [14-16] 扩增筛选和 SDS分析显示，pYeDP60-Dsred 重组表 （bimolecular fluorescent complementary ，BiFC ） 达载体已成功导入酿酒酵母菌中，诱导表达产物相对分子质 等蛋白互作技术研究提供实验依据。