DNA印迹与杂交技巧.ppt

第三节 核酸分子杂交技术;一、 分子杂交的基本方法;二、核酸分子杂交的基本原理;Hybridization of Nucleic Acids; （一）DNA变性与复性;2、变性的方法： （1）热变性：温度升高到90~100℃时，双链核酸 分子链间的氢键完全断裂。 （2）酸碱变性：pH值低于3或高于10时，双链核 酸分子链 间的氢键断裂。 （3）化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使 双链核酸分子链间的氢键断裂。 ;3、变性后的理化性质变化： 粘度降低 密度增加 紫外吸收值增加; 复性 1、定义：变性的单链核酸分子在一定条件下按碱基互补原则重新结合为双链核酸的过程，称复性或杂交。 具有互补序列的两条单链核酸都可互补形成双链：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、寡核苷酸/DNA和寡核苷酸/RNA。;2、复性过程 （1）单链分子间碰撞形成局部双链 （2）局部双链周围的碱基如不配对时，双链重新解离 （3）局部双链周围的碱基如配对，则形成中心序列 （4）形成完整的双链分子;核酸的分子杂交;三、Southern blotting DNA印迹与杂交; 在大多数核酸杂交反应中，经过凝胶电泳分离的DNA或RNA分子，都必须通过毛细管或电导作用被转移到滤膜上，而且是按其在凝胶中的位置原封不动地“吸印”上去的，因此，核酸杂交也被称为“DNA印迹杂交”。; 杂 交 模 式 图;Southern bloting的主要步骤;（a）;1. 待测DNA样品的制备、酶切 DNA的提取原理：裂解细胞，使DNA释放，交替使用酚、氯仿两种蛋白质变性剂，有效去除蛋白质 标准程序：酚——酚-氯仿——氯仿。;韧逛瞅茸萌型鱼吞掸婴息系峰栗遵访框递沫娩砧陡拔翼报袁肆邻刷琶骡亲DNA印迹与杂交技术DNA印迹与杂交技术;2. 待测DNA 样品的电泳分离： 琼脂糖凝胶电泳; bp —1534 — 994 — 695 — 515 — 377 — 237;3. 凝胶中DNA的变性：碱变性 ;4. Southern转膜(印迹) 待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物（如纤维素膜）上，即印迹。 ;4.1 固相支持物的选择 （1）理想的固相支持物应具备的特性 ①具有较强结合核酸分子的能力 ②不影响与探针的杂交反应 ③与核酸分子结合稳定牢固 ④具有良好的机械性能 ?非特异吸附少;4.2 常用的固相支持物 ①硝酸纤维素膜：优点是吸附能力强，杂交信号本 底低。缺点是DNA分子结合不牢固 ②尼龙膜：优点是结合单链，双链DNA的能力比硝酸 纤维素膜强；缺点：杂交信号本底高 ③化学活化膜：优点：DNA与膜共价结合；对不同 大小的DNA片段有同等结合能力；缺点：结合能 力较上述两种膜低;4.3 Southern印迹的常用方法 （1）毛细管虹吸印迹法;蹭掠梧片蠢磨沮迫凝夯彭斡东舜梧豁梭痕户冻航猛僧涸恩右缠谭嘱据琢臼DNA印迹与杂交技术DNA印迹与杂交技术;（2）电转法;（3）真空转移法;; 各种转移方法的比较 i) 毛细管虹吸法：操作简便，不需要特殊转移仪器，但转移效率低,（扩散法为70%，毛细管法80%）耗时多。 ii) 电转移法：效率高，耗时少，需特殊转移仪，对转移条件要求较严。 iii) 真空转移法：效率高，耗时最少，需特殊真空转移仪。;转移的最佳条件 i) 固定基质的选择 ii) 转移前预处理：DNA和RNA分子变性，蛋白质则需除去凝胶中的SDS。 iii)大分子的转移 　对于分子量较大的DNA片段，必须进行原位断裂后再进行转移，断裂DNA分子最佳长度为1-2kb。 其步骤是： 0.25M HCl处理凝胶两次（每次15分钟）→水洗→0.5M NaOH/1M NaCl两次，每次15分钟→转移。; 5、Southern杂交 1、预杂交：封闭膜上能与DNA结合的位点 预杂交液为不含DNA探针的杂交液 2、杂交