大鼠原代肝星形细胞的分离与鉴定.pdfVIP

第 32卷 第 1期 广西师范大学学报 ：自然科学版 Vo1．32 No．1 2014年 3月 JournalofGuangxiNormalUniversity：NaturalScienceEdition M ar．2O14 大 鼠原代肝星形细胞的分离与鉴定 曾淑兰 ，安运锋 ，卢 超 ，张立杰 ，张国海 (广西师范大学 化学与药学学院 ，广西 桂林 541004) 摘 要 ：本文通过二步原位灌注的方法分离得到大鼠肝脏 ，随后通过机械剪切 ，用 0．2g／l链霉蛋 白酶 E，0．2 g／L胶原酶Ⅳ以及 0．1g／LDNaseI消化和分散 ，筛网过滤、经 130g／LNycodenz密度梯度离心后收集肝星 状细胞 ，经台盼蓝染色后用细胞计数仪鉴定细胞存活率 ，a—sMA(平滑肌动蛋 白)免疫细胞化学染色法鉴定肝 星状细胞纯度 。结果显示 ，肝星状细胞的得率为每个肝脏 3．5×1O 个细胞 以上 ，肝星状细胞纯度为 95 左 右 ，肝星状细胞存活率为(97．0士3．2) ，满足实验需要 。 关键词 ：肝星状细胞 ；细胞分离 ；原代培养 ；鉴定 中图分类号 ：R735 文献标识码 ：A 文章编号 ：1O0卜6600(2014)01-0123—04 肝星状细胞 (hepaticstellatecell，HSC)，又称肝储脂细胞 、维生素 A储存细胞 、Ito细胞 、窦周细胞 ，正 常情况下表现为富含 VitA脂滴的静止型，又称静息态 (quiescent)l1]。正常肝组织 中的 HSC为静息态， 与肝纤维化无关 ，在各种肝损伤因素 的刺激下 ，静息态的 HSC会转变为激活态的 HSCl2 。激活态的 HSC会分泌多种细胞 因子 ，形成细胞因子的调解 网络，这些因素一方面会激活其他静息态的HSC并使其 大量增殖 ，另 一方 面使 激 活 的 HSC 快 速转 变 为 MFB(myofibroblast)，从 而 合成 大量 的 ECM (extracellularmatrixc)，并使得 ECM 的合成与降解发生紊乱，最终导致大量 ECM 积聚 ，从而引发肝纤维 化L3]。鉴于 HSC在肝纤维化中的重要作用 ，分离高纯度的原代 HSC成为肝纤维化研究的基础工作之一 。 本研究在参考 国内外文献的基础上 ，反复摸索确立一种快速、稳定的分离方法。 1 材料与方法 1．1 实验材料 1．1．1 实验动物 Wistar大鼠，雄性 ，SPF级，体质量 (350±10)g，由复旦大学上海医学院动物实验中心提供 。 1．1．2 试剂 DMEM 购 自Invitrogen，胎 牛血清 (FBS)购 自Hyclone，链 蛋 白酶购 自Roche，肝素钠、胶原酶 、 Nycodenz均购 自Sigma，烟碱酰胺购 自碧云天，戊 巴比妥钠购 自国药集团，DNaseI购 自华美生物。 1．1．3 试验设备 蠕动泵 ，生物安全柜 (Thermo)，CO 培养箱 (Thermo)，倒置 显微镜 (Nikon)，高速冷冻离 心机 (Eppendorf)，水浴锅 ，超净工作 台，恒温摇床 ，细胞计数仪 (TC10)。 1．1．4 灌注液和酶消化液 第一灌注液采用 D-Hanks液 (含 2U／mL肝素钠)，第二灌注液为含酶 Hanks液 (0．5g／I胶原酶 、 收稿 日期 ：2013—09—30 基金项 目：广西 自然科学基金资助项 目(2O13GXNsFBAO19159)；广西 医药产业人才小高地基金资助项 目(1309， 1312)；药用资源化学与药物分子工程教育部重点实验室主任基金资助项 目(CMEMR2012-A15)；地方高校 国家级大学生创新训练基金资助项 目(201210602022) 通信联系人 ：张 国海 (1984一)，男，山东聊城人 ，广西师范大学助理研究员。E—mail：zhangguohaiwansui@126．corn l24 广西师范大学学报 ：自然科学版 第 32卷 1g／I链霉蛋白酶 、体积分数为 5 的FBS)，消化液 (含酶 Hanks液 、含 0．2g／